بخشی از مقاله
چکیده:
ایران منبع غنی واریتههاي گوناگون بادام میباشد که هنوز ژنوتیپ S آنها به طور صحیح شناسایی و تایید نشده است. رقم مامایی یکی از ارقام مهم ایران داراي خصوصیات مطلوب از جمله بازارپسندي، مزه و طعم خوب آجیل، گلدهی متوسط تا دیر و عملکرد بالا میباشد که خودناسازگار بوده و ژنوتیپ S آن همچنان نامشخص باقی مانده است. تا امروز 39 آلل S-RNase شناسایی شده که وجود فعالیت ریبونوکلئازي آنها اثبات گردیده است. در این مقاله ژنوتیپ S رقم بادام مامایی از طریق بسط اینترون اول، دوم، توالی یابی طول کامل ژن S-RNase و بررسی فعال/غیرفعال بودن فرآوردههاي پروتئینی ژن S-RNase بررسی شد.
نتایج توالییابی نشان داد که آلل S25-RNase رقم مامایی حاوي جهش نقطهاي تولید کننده کدونهاي پایان زودهنگام - PTCs - 1 میباشد. بررسی فعال/غیر فعال بودن فرآورده پروتئینی ژن S-RNase با استفاده از ژل 2IEF اثبات نمود که رقم مامایی داراي یک آلل S-RNase منحصربهفرد و فاقد فعالیت ریبونوکلئازي میباشددلیل. این امر احتمالاًعدم فرار آلل S25x-RNase از سیستم تجزیه کننده mRNAهاي حاوي کدون بیمعنی3 - NMD - است. این بررسی اطلاعات قابل توجهی درباره وجود PTCs در سیستم خودناسازگاري بادام و تاثیر آن ها در غیر فعال شدن فرآورده ژن S-RNase ارائه میدهد. وجود PTCs در توالی S-RNaseقبلاً گزارش نشده است.
کلمات کلیدي: بادام، اصلاح، خودناسازگاري، آلل S-RNase
معرفی:
یکی از سیستمهاي خودناسازگاري - SI - شناخته شده خودناسازگاري گامتوفیتی - GSI - است که تشخیص گرده خودي از گرده غیرخودي را از طریق تشخیص ژنوتیپ S گرده امکانپذیر ساخته و منجر به دفع و عدم رشد لوله گرده خودي میگردد. خودناسازگاري گامتوفیتی - GSI - در سه خانواده رزاسه1، سولاناسه2 و اسکروفولاریاسه3 تحت کنترل یک ناحیه ژنومی بسیار چندشکل به نام لوکوس S میباشد. لوکوس S دربرگیرنده دو ژن است که اجزا اصلی نر و ماده موثر در تشخیص گرده خودي/غیرخودي را کد مینمایند. جز اصلی ماده در تشخیص گرده خودي، یک گلیکوپروتئین - PI = 8-10 - میباشد که فعالیت ریبونوکلئازي دارد. جز اصلی نر در سیستم GSI به عنوان پروتئین کوچکی که داراي یک ناحیه F-box در انتهاي N خود میباشد - پروتئین - SFB شناخته شده است . - 1 -
گلیکوپروتئینهاي کوچک فرآورده ژن S-RNase داراي ساختار حفاظت شده ضروري میباشند که وجود دو اسید آمینه حفاظت شده هیستیدین و سیستئین در فعالیت ریبونوکلئازي آنها نقش مهمی دارد. در توالی اسید آمینه ژن S-RNase، ناحیه سیگنال پپتید توسط 5 ناحیه حفاظت شده C1 - ، C2، C3، RC4 و - C5 دنبال میشود که در بین خانوادههاي رزاسه، سولاناسه و اسکروفولاریاسه به استثناي ناحیه C4 که مخصوص خانواده رزاسه بوده و RC4 نیز نامیده شده - 16 - ، مشابهاند. ساختار ژن S-RNase در خانواده رزاسه داراي یک ناحیه کدشونده بسیار متغیر4 - RHV - میباشد که بین نواحی حفاظت شده C2 و C3 واقع شده این در حالی است که در دو خانواده مذکور دیگر، دو ناحیه کدشونده بسیار متغیر یعنی HVa و HVb وجود دارند 6 - و . - 15 علاوهبراین توالی ژن S-RNase جنس Prunus - از خانواده رزاسه - حاوي دو اینترون میباشد که اینترون اول بین نواحی سیگنال پپتید وC1 و اینترون دوم بین نواحی حفاظت شده C2 و C3 یعنی درون ناحیه بسیار متغیر قرار گرفته است . - 1 -
دو روش مولکولی معمول مورد استفاده براي پیش بینی روابط ناسازگاري و ژنوتیپ S ارقام بادام عبارتند از: بررسی فرآورده ژن S-RNase براساس توالییابی فرآورده واکنش .PCR و دوم تهیه زیموگرام5 پروتئینهاي خامه و بهدنبال آن رنگآمیزي ژل IEF براي فعالیت ریبونوکلئازي ژن 2 - S-RNase، 3 و . - 4 طی بررسی فرآوردههاي PCR، مواردي وجود دارد که تعیین قطعی ژنوتیپ S را به خاطر عدم تکثیر فرآورده - که شاید ساختار اینترون از تکثیر جلوگیري مینماید - - - 14 دشوار میسازد. در نتیجه ژنوتیپ قطعی S توسط بررسی الگوي زیموگرام قابل توضیح میشود. ایران منبع غنی واریتههاي گوناگون بادام میباشد که برخی از این ارقام کشت میشوند - 5 - ، در حالی که هنوز ژنوتیپ S آنها به طور صحیح شناسایی و تایید نشده است. رقم مامایی یکی از ارقام مهم ایران، داراي خصوصیات مطلوب از جمله بازارپسندي، مزه و طعم خوب آجیل، گلدهی متوسط تا دیر و عملکرد بالا میباشد که خودناسازگار بوده و ژنوتیپ S آن همچنان نامشخص باقی مانده است . - 13 - در این مقاله آلل S25-RNase رقم بادام مامایی از طریق تکثیر اینترون اول و دوم، توالییابی طول کامل S25-RNase و بررسی فعال/غیر فعال بودن آلل S25-RNase بررسی شده است.
مواد و روش ها:
DNA ژنومی رقم مامایی با روش تغییر یافته CTAB استخراج گردید . - 9 - واکنش PCR با استفاده از جفت آغازگر PaConsІ- - 12 - F و - 10 - EM-PC1consRD براي بسط اینترون اول، آغازگرهاي EM-PC2consFD و - 10 - EM-PC3consRD براي بسط اینترون دوم و جفت آغازگر PaConsІ-F و - 11 - EM-PC5consRD براي تکثیر طول کامل و توالییابی انجام شد. واکنش هاي PCR طبق ارتگا6 و همکاران 2006 - و - 2005 انجام شد. فرآوردههاي مربوط به بسط طول کامل آلل S25-RNase پس از خالصسازي درون حامل پلاسمیدي pTZ57R/T کلون گردید، ورود قطعه از طریق PCR با آغازگرهاي M13 تایید و دو کلون حاوي آلل مذکور توالییابی شد. توالیهاي DNA ژنومی تحت نام HQ622700 با توالیهاي موجود در NCBI توسط BLASTnو - http://www.ncbi.nlm.nim.nih.gov/ - BLASTp مقایسه شد. استخراج پروتئین، شرایط انجام الکتروفورز IEF و رنگ آمیزي ژل براي فعالیت ژن S-RNase بر طبق روش بانوویک1 و همکاران - 2008 - انجام شد.
نتایج و بحث:
با استفاده از آغازگر PaConsІ-F وEM-PC1consRD نوارهایی به طول 330 و bp400 و با استفاده از آغازگرهاي EM-نوارهایی به طول 850 و bp1100 بسط یافت. الگوي نوارهاي مربوط به اینترون اول/دوم بااندازه bp1100/400 بیانگر آلل S22-RNase و با اندازه bp850/330 نیز بیانگر آلل S25-RNase میباشد که هر دوقبلاًگزارش شدهاند. آلل S25-RNase رقم ’مامایی‘ با طول کامل bp241 - bp1519 طول اینترون اول و bp633 طول اینترون دوم - از نظر توالی نوکلئوتیدي 99 درصد شباهت با آلل S25-RNase رقم‘La Mona’ emb|AM231673.1| نشان داد ولی آلل مذکور داراي یک جهش نقطهاي C→T در موقعیت bp1260 در اگزون 3 میباشد که تولید یک کدون ترجمه پایان زودهنگام مینماید.
از نظر توالی اسید آمینه این آلل تا قبل از جهش نقطهاي 100 C→T درصد یکسانی با آلل P. dulcis S 25-RNase نشان میدهد. آلل مذکور تحت نام S25x-RNase نامگذاري گردید. پروتئین خامه رقم ’مامایی‘ بر اساس روش بانوویک و همکاران، 2008 استخراج و پس از رنگآمیزي ژل IEF براي فعالیت ریبونوکلئازي ژن S-RNase بررسی گردید. بررسی IEF نشان داد که تنها یکی از آللهاي رقم ’مامایی‘ داراي فعالیت ریبونوکلئازي و آلل S-RNase دیگر غیرفعال میباشد. نتایج حاصل از توالییابی S25x-RNase رقم ’مامایی‘ نشان میدهد که جهش نقطهایی تولید کننده PTCs باعث میگردد که توالی اسید آمینه پروتئین حاصله فاقد 71 اسید آمینه در نواحی RC4 و C5 باشد.
از آنجاکه وجود نواحی حفاظت شده C1 تا C5 و همچنین ناحیه بسیار متغیر RHV براي فعالیت ریبونوکلئازي ژن S-RNase ضروري است، پس فقدان این نواحی میتواند بروي فعالیت فرآورده این ژن تاثیرگذار باشد. فرآورده آلل S25x-RNase تنها داراي نواحی حفاظت شده C1، C2،RHV و C3 بوده و بنابراین میتوان گفت که PTCs در آلل S25x-RNase رقم مامایی در موقعیتی قرار دارد که رونوشت این آلل توسط سیستم NMD به عنوان رونوشت ناقص شناسایی و در نتیجه تجزیه گردد. غیر فعال بودن آللهاي S-RNase میتواند به عنوان روش جدید در روشهاي اصلاحی بادام که هدفشان تولید ارقام خودسازگار است به جاي انتقال آلل خودسازگاري - Sf - از ارقام حاوي این آلل به ارقام خودناسازگار به کار گرفته شود.
