بخشی از مقاله
چکیده
Thryssa whiteheadi تنها گونه بومی گزارش شده از خانواده آنچویماهیان - Engraulidae - است که به لحاظ پراکنش جغرافیایی به طور انحصاری در حوضه خلیجفارس و دریایعمان یافت میشود. در این پژوهش خصوصیات مورفولوژیکی و مولکولی این گونه به طور دقیق با استفاده از تکنیک بارکدگذاری DNA بررسی شد. به همین منظور، بعد از نمونهبرداری، DNA استخراج و با کمک یک جفت آغازگر جهانی، ژن سیتوکروم اکسیداز زیر واحد1 تکثیر و تعیین توالی شد.
پس از تجزیه و تحلیل، نتایج بدست آمده با سایر گونههای موجود در بانک ژن مقایسه شد و نام علمی و توالی ژن COI برای نخستین بار در بانک ژن و پایگاه دادههای بارکد، ثبت جهانی گردید. طبق بررسی انجام شده برای این گونه، مقدار فاصله ژنتیکی درون گونهای بر اساس مدل K2P صفر بدست آمد و فاصله ژنتیکی آن با سایر گونه ها به طور متوسط 15/33 درصد محاسبه شد.
مقدمه
خانواده Engraulidae معروف به آنچویماهیان، متعلق به راسته شگماهیشکلان - Clupeiformes - است که به طور کلی شامل، 2 زیر خانواده، 17 جنس و 144 گونه است . - Eschmeyer, 2013 - سه جنس از این خانواده شامل Stolephorus، Encrasicholina و Thryssa که دارای14 گونهاند از آبهای خلیجفارس و دریایعمان گزارش شده است - دلفیه و همکاران، . - 1390 این سه جنس منحصراً در آبهای اقیانوس هند و آرام پراکنش دارند - Nelson, 2006 - که در این میان، گونه Thryssa whiteheadi به عنوان تنها گونه بومی از این خانواده در آب های خلیج فارس و دریای عمان گزارش شده است . - Whitehead et al., 1988 -
در بازنگری ردهبندی خانواده Engraulidae عنوان شده است که Thryssa whiteheadi، جایگاه ردهبندی مشخص و واضحی ندارد و این گونه مترادف با گونه Thryssa mystax میباشد - دلفیه و همکاران،. - 1390 در بازنگری و اصلاح تاکسونومی ماهیان استخوانی موزه تاریخ طبیعی ایران، این گونه به عنوان گونهی کمیاب معرفی شد - عوفی و ربانیها ،. - 1392 به نظر میرسد بیشتر مطالعات انجام شده برروی این گونه منحصر به بررسی فون ماهیان خلیجفارس و دریای عمان بوده است . - Whitehead et al., 1988; Randall, 1995; Carpenter et al., 1997 - شناسایی و مطالعه نمونههای با ارزش بومی و به خصوص کمیاب از جمله گامهای پایه در جهت حفاظت از تنوع زیستی به شمار میرود.
تکنیک DNA بارکدگذاری یکی از نوینترین روشهای شناسایی موجودات است که از DNA میتوکندریایی، برای شناسایی دقیق و سریع گونهها استفاده مینماید Hebert . - Costa and Carvalho, 2007 - و همکاران در سال 2003 برای اولین بار تکنیک بارکدگذاری DNA را با استفاده از DNA میتوکندریایی، بر پایه ژن سیتوکروم اکسیداز زیر واحد - COI - 1 به عنوان یک سیستم شناسایی زیستی جهانی برای تمایز همه یا حداقل اکثریت گونههای جانوری پیشنهاد کردند. هدف از این تحقیق شناسایی دقیق مورفولوژی گونه Thryssa whiteheadi از جنگلهای مانگرو تیاب استان هرمزگان و تعیین توالی نوکلئوتید های ژن COI با استفاده از بارکدگذاری DNA و ثبت جهانی آن در بانک ژن - NCBI - و پایگاه دادههای بارکد - BOLD - میباشد.
مواد و روشها
نمونهبرداری از ماهیان جنگلهای مانگرو تیاب با مختصات جغرافیایی - 27 04'17 '' N -56 50'04 '' E - در خرداد ماه 94 انجام گرفت و نمونهها بلافاصله در اتانول 96 درصد فیکس و به آزمایشگاه ماهی شناسی دانشگاه هرمزگان منتقل شدند و سپس شناسایی آنها با توجه به کلیدهای شناسایی فائو انجام گرفت . - Whitehead et al., 1988 - از ویژگیهای برجسته موجود در کلیدهای شناسایی با استفاده از لوپ استریو عکس تهیه شد و سپس به منظور انجام آنالیزهای مولکولی شش قطعه ماهی انتخاب شد و در آزمایشگاه بانک مولکولی مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران آزمایشهای مولکولی انجام گردید.
سپس استخراجDNA از قسمت عضله ساقه دمی ماهی با استفاده از کیت استخراج DNA ژنومیک خون و سلول انسانی و حیوانی تولید شده در مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران - cat no. MBK0021 - انجام گردید. بعد از الکتروفورز و رنگ آمیزی ژل در اتیدیومبروماید، با دستگاه مستندسازی ژل - Gel Document - از آن عکس گرفته شد. جهت تکثیر ژن - COI - با طول تقریبا 652 جفت باز از جفت پرایمرهای - LCOI490-HCO2198 - معرفی شده توسط Folmer و همکاران - 1994 - استفاده گردید. تکثیر ژن با چرخههای حرارتی مورد استفاده برای بسط قطعه مورد نظر انجام گرفت.
هر واکنش PCR با حجم 50 میکرولیتر، از آنزیم تکپلیمراز 0/5 میکرولیتر - با غلظت 5 واحد آنزیم بر میکرولیتر - ، 3 میکرولیترکلرید منیزیم - با غلظت 25 میلی مولار - ، بافر - 2 - 10 X میکرولیتر، از پرایمرها 0/5 میکرولیتر - با غلظت 10 پیکومول - ، مخلوط 0/7 میکرولیتر dNTP - با غلظت 10 میلی مولار - ، 1-2 DNA میکرولیتر و H2O استفاده گردید. برای اطمینان از تکثیر ناحیه مورد نظر، از الکتروفورز ژل آگارز %1 استفاده شد و سپس با دستگاه مستندسازی ژل از آن عکس گرفته شد. به منظور توالییابی دو طرفه ژن مورد نظر، بعد از خالص سازی محصول PCR با کیت تخلیص - cat no. MBK0071 - PCR، تولید شده در مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران به آمریکا ارسال شد.
کروماتوگرامهای به دست آمده از ژن مورد نظر در ابتدا با استفاده از نرم افزار Seq Man متعلق به DNA STAR Laser gene ردیف یابی - Align - شدند. توالی های بدست آمده به بانک ژن - NCBI - و پایگاه دادههای بارکد - BOLD - ارسال شدند. به منظور مقایسه 6 توالی به دست آمده با سایرگونه های همجنس از توالیهای ثبت شده در بانک ژن استفاده شد و درخت تبار شناسی Neighbor joining براساس مدل دو پارامتری کیمورا با 1000 تکرار برای آنها در نرم افزار Mega6 ترسیم گردید . - Kimura, 1980., Tamura et al., 2013 -
نتایج
خصوصیات ریخت شناسی گونه Thryssa whiteheadi در شکل 1 قابل مشاهده می باشد. شکل .1 خصوصیات ریخت شناسی گونه Thryssa whiteheadi -1 امتداد نوک پوزه بالای سطح مرکز چشم قرار دارد؛ -2 استخوان فک بالایی به طور واضح کمی آنسوی سرپوش آبششی قرار دارد؛ -3 دندان های فک بالایی در این گونه برخلاف گونه های دیگر بزرگ هستند و روی استخوان فکی فقط یک استخوان پیش فکی وجود دارد؛ -4 استخوان پیش فکی اول - - 1 در این گونه وجود ندارد؛ -5 تعداد خارهای آبششی در قسمت پایینی کمان آبششی 19-21 می باشد؛ -6 پرزهای روی خارهای آبششی به صورت منفرد است.
علاوه بر ویژگی های عکس گرفته شده تعداد شعاع های باله پشتی 3 - شعاع غیرمنشعب و 10-11 شعاع منشعب - ، شعاع باله مخرجی - - 19-20،تعداد کیل قبل از باله شکمی - - 15-16 و بعد از باله شکمی - - 9-10، شمارش و همچنین، طول استاندارد - 14-10/5 - و طول کل - 12/5- 16/5 - اندازه گیری شد. با ارسال توالی گونه Thryssa whiteheadi به مرکز BOLD هیچ شباهتی با توالیهای ثبت شده در این مرکز نشان داده نشد اما با ارسال آن به بانک ژن - NCBI - ، بیشترین شباهت را با گونه 94 - Thryssa dussumieri درصد - نشان داد. نتایج هم ردیفی نوکلئوتیدی قطعه توالی یابی شده با سایر توالی های نوکلئوتیدی همجنس ثبت شده دربانک ژن در شکل 2 نشانداده شده است.
