بخشی از مقاله
چکیده
در این تحقیق، شناسایی مورفولوژیک و مولکولی و همچنین ارزیابی محتوای آمینو اسیدی جلبک قهوهای Halothrix ambigua گونه غالب ساحل نیروگاه اتمی بوشهر مورد بررسی قرار گرفت. نمونهبرداری جلبک در پاییز و زمستان 93 از نواحی بین جزر و مدی انجام شد. مشاهدات مورفولوژیکی جلبک با جزئیات کامل، با استفاده از کلیدهای شناسایی معتبر و میکروسکوپ انجام شد.
بمنظور شناسایی مولکولی، ابتدا ژنوم جلبک با روش تغییر یافته CTAB استخراج شد و سپس تکثیر قطعات ژنومی توسط پرایمر ریبوزوم هستهای ITS-2 انجام شد. بمنظور آنالیز توالی های ژنومی، از نرم افزارهای ژنتیکی Chromas، BioEdit و MEGA7 استفاده شد. جهت تعیین جایگاه گونه و بررسی قرابت ژنتیکی، درختهای فیلوژنی NeighborJoining و Fast Minimum Evolution رسم شدند. جهت تعیین پروفایل آمینو اسیدی جلبک قهوه ای مورد بررسی، از روش نین هیدرین و آمینو اسید آنالایزر استفاده شد. نتایج شناسایی مورفولوژیک، گونه Halothrix ambigua را تائید نمود.
در حالیکه نتایج بررسی های مولکولی، و مقایسه با گونه های وابسته، مشابهت 79 درصدی با گونه Halothrix ambigua را نشان داد. نتایج ارزیابی محتوای آمینو اسیدی جلبک Halothrix ambigua بیانگر این بود که بیشترین میزان اسید آمینه مربوط به اسید آمینه آرژنین - - 12/63 و سرین - - 11/62 می باشد. بنابراین، با توجه به فراوانی و گسترش جلبک های قهوه ای در سواحل نیروگاه اتمی بوشهر، می توان با استفاده از روشهای زیست فناوری دریا، و بهره برداری بهینه و پایدار، از این منابع غنی و ارزشمند دریایی در پزشکی، داروسازی، صنایع غذایی و آرایشی بهداشتی استفاده نمود.
مقدمه
جلبک های ماکروسکوپی، موجودات دریایی فتوسنتز کنندهای هستند که از نظر اکولوژیکی نقش مهمی دارند. این موجودات بر خلاف سایر گیاهان عالی فاقد ساختارهایی مانند ریشه و برگ حقیقی هستند. پیکر رویشی جلبک ها از سلولهای کوچک منفرد تا ساختمانهای پر سلولی پیچیده تغییر میکند . - Miyashita et al., 2013 - شناسایی مورفولوژیکی جلبک ها سابقه طولانی دارد.
بسیاری از گونه های ناشناخته روابط فیلوژنی پیش بینی نشدهای را نشان میدهند که شناسایی این جلبکها را با مشکلاتی مواجه میسازد. جلبکها از نظر مورفولوژیکی دارای تکامل همگرا بوده که این موضوع شناسایی گونهایی را تقریبا ناممکن میکند. - DNA . - Shams et al., 2015 بارکدینگ امکان شناسایی گونه-های ناشناخته را با توجه به بالا بودن تنوع زیستی درون گونهای و پراکنش جغرافیایی گونهها امکان پذیر میسازد. جلبک های قهوه ای شباهت ریختشناسی زیادی دارند که بر اساس نوع زیستگاه میزان شباهتهای ریخت شناسی دو گونه بیشتر و یا کمتر میشود. در نتیجه شناسایی دو گونه به عنوان دو گونه جدا از هم تنها بر اساس مطالعات ریخت شناسی ممکن نیست . - Saunders, 2005 -
مقدار پروتئین و آمینواسید از جمله عوامل اصلی تشخیص کیفیت مواد غذایی جلبکی است - Manivannan et al., 2008 - . میزان پروتئین جلبکهای دریایی مختلف، تفاوت زیادی با هم دارند. میزان این مواد بستگی به شرایط زیست محیطی گونهها دارد برای مثال در گونههای Hizikia fusiforme، Undaria pinnatifida و Laminaria japonica میزان پروتئین حدود 7-16 گرم در هر100 گرم وزن خشک محاسبه شده است .
- Ruperez and Saura-Calixto, 2001 - با توجه به اهمیت حفظ و حراست از تنوع زیستی جلبک های دریایی سواحل خلیج فارس و همچنین بهره برداری از ترکیبات زیست فعال آنها، هدف از تحقیق حاضر، شناسایی مورفولوژیک و مولکولی گونه غالب جلبک قهوه ای در ساحل نیروگاه اتمی بوشهر و بررسی محتوای آمینو اسیدی این جلبک ها بوده است.
مواد و روشها
ابتدا نمونههای جلبک قهوه ای در زمان جزر کامل از محل رویش آنها با دست جمع آوری گردید. سپس با آب دریا شستشو داده شد و به صورت جداگانه در کیسههای پلاستیکی در کنار یخ قرار داده شده و به آزمایشگاه منتقل گردید. نمونههای جلبکی در آزمایشگاه با آب دریا و سپس آب مقطر شست و شو داده شد و جهت نگهداری به فریزر-20 انتقال داده شد.
جهت شناسایی هر یک از نمونههای جلبکی در آزمایشگاه، خصوصیات ریختشناسی آنها - رنگ، شکل برگ، کیسههای هوایی، محور ساقه، قلاب پایه نگه دارنده - به دقت بررسی گردید و همچنین از نمونهها عکسهایی جهت مقایسه با کلیدهای شناسایی معتبر، تهیه شد. سپس مشخصات مذکور با کلیدهای شناسایی، تطبیق داده شده و در نهایت، شناسایی نمونههای جلبکی صورت گرفت . - Abbas et al., 2009 -
جهت بررسی میکروسکوپی بافت پوششی برگ و کیسههای هوایی جلبکهای غالب قهوهای ابتدا برش عرضی از برگها و کیسههوا تهیه گردید. سپس به کمک میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی شیئی 10 و 40 و چشمی 10 نمونهها از نظر بافت شناسی با هم مقایسه شدند . - Abbas et al., 2009 - جهت استخراج ژنوم، نمونههای جلبکی که پس از شست و شو در فریزر -20 قرار گرفته بود را در زمان آزمایش از فریزر خارج کرده و به روش تغییر یافته CTAB ، DNA نمونهها استخراج شد . - Phillips et al., 2000 - برای انجام PCR و تکثیر ژن مورد نظر از پرایمر مولکولی ITS-2، 5.8S-BF: CGATGAAGAAGGCAGCGAAATGCGA و 25BR-2: TCCTCCGCTTAGTATATGCTTAA استفاده شد . - Yoshida et al., 2000 - محصولات PCR با باند مطلوب جهت تعیین توالی به شرکت بایونیرکره ارسال شدند.
کروماتوگرام توالیهای بدست آمده به منظور مقایسه توالی نمونه-های مورد بررسی با توالیهای مشابه در پایگاه اطلاعات ژنتیکی NCBI از برنامه BLAST به عنوان یکی از ابزارهای همردیفی توالیهای DNA استفاده گردید و میزان تشابه و همپوشانی و نیز شناسایی اولیه بر اساس دادههای مولکولی مشخص گردید. سپس از نرم افزارهای Chromas و BioEdit و MEGA7 جهت آنالیز مولکولی توالی ها و رسم درختهای فیلوژنی استفاده شد.
جهت آنالیز محتوای آمینواسیدی جلبکهای قهوهای مورد بررسی، ابتدا نمونه را در هوای آزاد به مدت یک روز قرار داده تا کاملا خشک شدند. سپس جلبکهای پودر شده با استفاده از واکنش نین هیدرین بعد از هیدرولیز اسیدی در HCL 6 - مولار - قرار گرفتند . - Bogolitsy et al., 2014 - ترکیب و درصد آمینو اسیدها نیز با استفاده از دستگاه آمینو اسید آنالایزر در طول موج 440 تا 570 نانومتر اندازهگیری گردید. همچنین میزان آمینواسیدهای هر نمونه جلبک طبق روش موجود، سنجیده و مقایسه شد. - - Chithra and Chandra, 2014
نتایج
در تحقیق حاضر، نمونه جلبک قهو ه ای با استفاده از کلیدهای شناسایی مورد مطالعه قرار گرفته و شناسایی شد. ویژگیهای مورد نظر در شناسایی و مطابقت با کلیدهای معتبر، شامل رنگ، شکل برگ، نوع اجسام شناور بودند. شناسایی مورفولوژیک جلبک قهوهای جنس Halothrix ambigua با استفاده از کلیدهای شناسایی انجام شد . - Abbas et al ., 2009 - پس از دریافت توالیها جهت شناسایی و بررسی مولکولی گونه Halothrix ambigua توالیهای به دست آمده با توالیهای موجود در بانک ژن نتایج حاصل از Blast، شباهت 79 درصدی را برای نمونه مورد مطالعه، Halothrix ambigua نشان داد.
به منظور رسم درختهای فیلوژنتیکی، 20 توالی مربوط به ژن ITS-2 که بیشترین شباهت را با نمونه Halothrix ambigua نشان دادند از بانک ژن انتخاب شدند و در تجزیه و تحلیل دادهها وارد گردید. سپس درختهای تبارزایی به روش Fast Minimum Evolution و پیوند همجواری - Neighbor Joining - ترسیم شدند. نتایج آنالیز مولکولی و رسم درختهای فیلوژنی به هر دو روش،توپولوژی نسبتاً مشابهی را نشان دادند. در روش Fast Minimum Evolution درخت مونوفیلتیک رسم شده برای نمونه - 1S - Halothrix ambigua با گونههای Halothrix ambigua از آبهای سواحل کره و Cladosiphon umezakii و Sphaerotrichia sp. در یک گروه قرار گرفتند
