بخشی از مقاله
مقدمه
مقایسه توالیهای rRNA ابزاری قوی برای روابط فیلوژنی و تکاملی در بین باکتریها، آرکئا و موجودات یوکاریوت است. این روشها تأییدی مطمئن برای شناسایی باکتریها تا سطح سویه میباشند. باکتری Sinorhizobium meliloti با یونجه که یکی از گیاهان علوفهای مهم و منبع تغذیه دامها ست رابطه همزیستی تثبیت کنندگی نیتروژن مولکولی هوا را دارد.
اتیلن یک هورمون گیاهی مهم برای رشد و نمو گیاهان است. با اینحال حضور این هورمون در غلظتهای زیاد در گیاهان در شرایط تنشی همچون شوری و خشکی موجب بروز مشکل در رشد گیاهان میشود. آنزیم ACCدآمیناز قادر است 1 - ACC -آمینوسیکلوپروپان--1کربوکسیلات - که پیشماده مستقیم اتیلن در گیاهان است را به آمونیوم و آلفاکتوبوتیرات تبدیل نماید، و از این طریق موجب کاهش اتیلن ناشی از تنش شود.
در ایران تنش های مختلفی از جمله شوری و خشکی خاک از عوامل مهم تنشی در گیاهان هستند. مطالعات نشان داده که استفاده از باکتریهای طبیعی یا نوترکیب مولد آنزیم ACCدآمیناز منجر به کاهش اتیلن تنشی شده است. لذا چنانچه سویه یا سویههایی از باکتریهای دارای مزیت-های مختلفی از جمله توان تولید این آنزیم را داشته باشند میتوانند اثرات بهتری در رشد گیاه داشته باشند. لذا دستیابی به ژن ACCدآمیناز راهکار مناسبی برای توسعه کودهای بیولوژیک و یکی از مهمترین اهداف این تحقیق بود.
مواد و روش ها
در این پژوهش 4 سویه Sinorhizobium meliloti بومی از نظر وضعیت ژن کد کننده آنزیم ACCدآمیناز - acdS - مورد بررسی قرار گرفتند. این سویهها از بین 168 سویه Sinorhizobium meliloti بر اساس میزان رشد در محیط کشت حاوی ACC و فاقد نیتروژن در مرحله اول - خسروی و همکاران، - 2010 و میزان فعالیت آنزیم ACCدآمیناز 20 - سویه انتخابی - بوسیله اندازهگیری مقدار آلفاکتوبوتیرات تولید شده در مرحله دوم تعیین شد.
با توجه به دشواری استخراج DNA ژنومی از ریزوبیوم، از روش فنل کلروفرم اصلاح شده Agrawal - و همکاران، - 2006 استفاده شد. ژن 16S rRNA از DNA کروموزومی سویهها توسط PCR و با استفاده از پرایمرهای fD1 و Weisburg - rD1 و همکاران، - 1991 تکثیر و تعیین توالی شد.
بر اساس توالی ژن acdS موجود در بانک ژن دو پرایمر اختصاصی به نامهای ACCDF و ACCDR برای تکثیر ژن acdS طراحی شدند. ژنacdS توسط PCR و با استفاده از این پرایمرها از DNA کروموزومی و DNA کل سلول تکثیر و در وکتورهای پلاسمیدی pTZ57R/T کلون و به باکتری E. coli DH5 منتقل شد. توالی ژن های acdS تعیین شد. این توالیها با استفاده از برنامه BLAST با سایر توالیهای موجود در بانک ژن - Data bases - مقایسه شدند.
نتایج و بحث
جدایه KYA40 دارای%99 مشابهت باSinorhizobium sp BK1 ، جدایه KYA27 دارای %99 مشابهت با
Sinorhizobium sp. CCBAU 83493 ، KYA71 دارای %100 مشابهت با Sinorhizobium sp., BK1، جدایه KYA95 دارای %99 مشابهت با .Sinorhizobium meliloti S33 بود. نتایج بدست آمده حکایت از این دارد که روشهای معمول که برای شناسایی باکتریهای ریزوبیوم در ایران بکار میرود با روشهای ژنتیکی مطابقت دارد. نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم ACCدآمیناز در سویههای انتخابی بین صفر تا 326 نانومل آلفاکتوبوتیرات در میلیگرم پروتئین در ساعت بود
جدول -1 فعالیت آنزیم ACCدآمیناز سویه های انتخابی
سویه KYA40 دارای بیشترین رشد در محیط ACC و فعالیت آنزیمی 136 نانومل آلفاکتوبوتیرات در میلیگرم پروتئین در ساعت، KYA71 دارای رشد متوسط در محیط ACC و فعالیت آنزیمی 326 نانومل آلفاکتوبوتیرات در میلیگرم پروتئین در ساعت، KYA27 دارای رشد کم در محیط ACC و فاقد فعالیت آنزیمی و KYA95 فاقد رشد در ACC و فاقد فعالیت آنزیم ACCدآمیناز. در شکل یک محصول PCR ژن16S rRNA بر روی ژل آگارز نشان داده شده است.
شکل-1 محصول PCR ژن 16S rRNA، خط 1 kb DNA ladder 1:، خطKYA27 :2، خطKYA40 :3، خط KYA71 :4، خط.KYA95 :5
بر اساس نتایج تکثیر ژن acdS توسط PCR نتیجه گیری شد این ژن درسویه KYA71 احتمالا بر روی DNA کروموزومی و در سویه KYA40 بر روی یکی از مگاپلاسمیدها واقع شده است - شکل . - 2 توالی ژن acdS و. ژن acdS در دو سویه KAY40 و KYA71 دارای 99 درصد مشابهت بودند.
شکل-2 محصول PCR ژن acdS، قسمت DNA - A ژنومی - و قسمت DNA - B مگاپلاسمیدی - خط 1 kb DNA ladder 1:، خطKYA27 :2، خطKYA40 :3، خط KYA71 :4، خطKYA95 :5
علیرغم تفاوت در سه نوکلئوتید، این دو ژن فقط در اسیدآمینه 48 - ترئونین در KYA40 و متیونین در - KYA71 با هم تفاوت نشان دادند. مقایسه توالی اسیدآمینه این دو سویه با سایر سویههای موجود در منابع نشان داد که از اسیدآمینه 37 تا اسیدآمینه 58در تقریباً همه سویهها مشابه است. این ناحیه میتواند به عنوان یک ناحیه حفاظت شده محسوب شود. لذا هر گونه تغییری در این ناحیه حفاظت شده ممکن است باعث تغییر در فعالیت آنزیم ACCدآمیناز شود
جدول -2 تفاوت نوکلئوتیدی بین ژن های acdS مربوط به KYA40 و KYA71
