بخشی از مقاله
چکیده
استفاده از نشانگرهاي مولکولی DNA براي مطالعه ژنتیکی و شناسایی ارقام یکی از مراحل اساسی در برنامه اصلاح گلابی است. در این مطالعه 28 نشانگر SSRs براي ارزیابی تنوع ژنتیکی بین ارقام و گونههاي گلابی شامل 41 رقم گلابی اروپایی از گونه Pyrus communis، 4 رقم گلابی ژاپنی از گونه P. pyrifolia و دو گونه وحشی - P. sasifolia and P. mazandaranica - استفاده شده است. تعداد آلل در هر مکان از سه تا 12 آلل متغیر بود. در مجموع 174 آلل شناسایی که به طور میانگین 6/21 آلل براي هر نشانگر ثبت شد.
هتروزیگوتی مشاهده شده از 0/17 در نشانگر TsuENH006 تا 0/96 در نشانگر NB103a متغیر بود. ضریب تشابه بین ارقام با داده هاي SSRs از SK9 - %30 و - P. mazandaranica تا SK7 - %93 و - SK9 به دست آمد. شاخص شانون براي مکان هاي ژنی بین 0/69 تا 2/04 ثبت شد.
نتایج به دست آمده نشان داد که نشانگر NB103a کارایی بالاتري نسبت به سایر آغازگرها در تفکیک ارقام داشتند. گروه بندي نمونه هاي مورد مطالعه با استفاده از ضریب تشابه و الگوریتم UPGMA، ارقام و گونههاي گلابی را به دو گروه اصلی شامل ارقام آسیایی و اروپایی تقسیم کرد. حضور برخی ارقام ایرانی در کنار نمونه هاي خوج بیانگر این موضوع است که این ارقام احتمالا از خوجها منشاء گرفته اند.
مقدمه
گلابی - Pyrus spp. - یکی از محصولات مهم میوه از خانواده گلسرخیان بعد از سیب است که در آسیا در طی 3000 سال اخیر مورد کشت و کار قرار گرفته است. در حال حاضر گلابی به صورت تجاري در بیش از 50 کشور در مناطق معتدله کشت می شود. جنس پیروس داراي حداقل 22 گونه شناخته شده اولیه است که همه آنها بومی آسیا، اروپا و نواحی کوهستانی شمال آفریقا هستند 2 - ، . - 3 در طی دهه هاي گذشته تلاش هاي بسیاري صورت گرفته است تا ارزیابی تنوع ژنتیکی در گلابی هاي اروپایی و آسیایی و سایر گونه هاي جنس پیروس با استفاده از مارکرهاي مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و DNA تعیین گردد.
در میان مارکرهاي DNAنشانگر SSRs چندین مزیت نسبت به سایر مارکر هاي مولکولی دارند و روش مطمئن تري براي انگشت نگاري DNA به کار می رود زیرا تعداد آنها در ژنوم بالا است و درجه بالایی از پلی مورفیسم را نشان می دهند و قابلیت اتوماتیک شدن دارند. همچنین این نشانگر داراي توارث همبارزي بوده و تعداد بالاي آلل در هر مکان را نشان می دهند
در سال هاي اخیر مارکر هاي SSRs به عنوان یک ابزار قوي در انگشت نگاري ژنتیکی ارقام گلابی بکار رفته است 5 - ، 8، . - 9 استفاده از مارکرهاي SSRs سیب براي تهیه نقشه ژنتیکی و ارزیابی تنوع ارقام گلابی همواره مورد توجه بوده است. در یک تحقیق 36 نمونه گلابی شامل 19 گلابی ژاپنی - - P. pyrifolia ، 7 گلابی چینی - P. bretschneideri و - P. ussuriensis، 5 گلابی اروپایی، 3 گلابی وحشی - P. calleryana - و 2 گلابی هیبرید میان پیروفولیا و کومونیس با مارکر SSRs مشتق شده از سیب مورد ارزیابی قرار گرفتند.
جفت پرایمر مورد استفاده در این مطالعه در تمام نمونه هاي گلابی قطعاتی را تکثیر کردند. توالی نوکلئوتیدي در SSRs ها و مناطق اطراف آنها در گلابی با سیب مقایسه شد و ثابت گردید این مناطق در گلابی بسیار حفاظت شده است. برخی از تفاوت ها در اندازه قطعات تکثیر شده میان گلابی یا بین سیب و گلابی از تفاوت تعداد تکرار ها منشاء می گرفت که به جهش هاي حذف و یا اضافه مربوط می شد
در تحقیق دیگري از 6 جفت پرایمر SSRs مشتق شده از گلابی براي ارزیابی تنوع ژنتیکی براي گلابی هایی که بیشتر آنها بومی آسیاي شرقی بودند استفاده شد که در مجموع 168 آلل بدست آمده است. همه مارکر هاي مورد بررسی سطح بالایی از پلی مورفیسم را با میانگین 28 آلل براي هر نشانگر نشان دادند.
در این تحقیق که از ارقام اروپایی هم استفاده شده بود نشان داده شد که ارقام غربی خویشاوندي ژنتیکی کمتري با ارقام آسیایی دارند Kimura . - 1 - و همکاران - 2002 - ، 58 نمونه گلابی از 6 گونه را با 9 مارکر SSRs مورد ارزیابی قرار دادند و 133 آلل مشاهده شد. آنها با آنالیز کلاستر 3 گروه اصلی چینی، ژاپنی و اروپایی را شناسایی کردند و به خوبی از هم تفکیک شدند اما گلابی هاي سفید چینی - P. ussuriensis - و P. sinkiangensis قابل تفکیک از یکدیگر نبودند.
مواد و روش ها
این تحقیق در گروه علوم باغبانی پردیس کشاورزي و منابع طبیعی دانشگاه تهران و موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج انجام شد. بررسی تنوع ژنتیکی بین 41 نمونه گلابی گونه Communis شامل ارقام داخلی و خارجی و 4 نمونه گلابی گونه Pyrifolia و 2 گونه داخلی از ژنوتیپ هاي وحشی با استفاده از 28 نشانگر SSR صورت گرفت
استخراج DNA ژنومی با کمی تغییر از برگ هاي جوان با روش Hasebe و همکاران - 1990 - و Yamamoto و همکاران - 2000 - صورت گرفت. به طور خلاصه، 0/5 گرم بافت برگ جوان در نیتروژن مایع پودر و 5 سی سی بافر استخراج - 2% CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, - 0.1 M TRIS-HCl, pH 8.0، 0/5 سی سی 10% sodium N-lauroyl sarcosinate, 20 mM EDTA, 0.1 M - lysis buffer - TRIS-HCl, pH 8.0، 0/1 سی سی مرکاپتواتانول و 50 میلی گرم PVP-40 به نمونه ها اضافه و به مدت یک ساعت در حمام آب گرم قرار گرفتند.
نمونه ها در دماي اتاق خنک و به نسبت 1:1 کلروفرم ایزوآمیل الکل - 24:1 - اضافه و به مدت 15 دقیقه در 9500 دور سانتریفیوژ شدند. روشناور به فالکون جدید منتقل و به مقدار 0/6 حجم محلول ایزوپروپانل سرد اضافه گردید. پلت DNA با اتانول %70 شستشو و بعد از خشک شدن در 0/5 سی سی آب مقطر استریل حل شد. واکنش زنجیره اي پلیمراز در حجم 15 ماکرولیتر شامل 25 نانوگرم DNA ژنومی، بافر 10X، 1/5 میلی مولار MgCl2، 0/2 میلی مولار dNTPs، 10 پیکومول از هر پرایمر و 1 واحد آنزیم Taq DNA Polymerase بود.
برنامه PCR شامل یک چرخه واسرشت سازي اولیه به مدت 4 دقیقه در دماي 94 درجه سانتیگراد و به دنبال آن 35 چرخه که به ترتیب شامل واسرشت سازي در دماي 93 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه، اتصال 55-50 - درجه سانتیگراد - بسته به نوع آغازگر به مدت یک دقیقه، تکثیر در دماي 72 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه و چرخه تکثیر نهایی به مدت هفت دقیقه صورت گرفت. بعد از واکنش پلیمراز به هر نمونه 5 ماکرولیتر بافر بار گذاري اضافه و به مدت 5 دقیقه در دماي 94 درجه واسرشته و نمونه ها بلافاصله به روي یخ منتقل و 3-2 ماکرولیتر از هر نمونه به همرا سایز مارکر در ژل پلی اکریل آمید %6 - ضخامت 0/4 میلیمتر - با ولتاژ 65 وات و دماي 50 درجه سانتیگراد به مدت یک الی دو ساعت بسته به اندازه آلل الکتروفورز گردید.
به منظور ظهور باندها رنگ آمیزي ژل با نیترات نقره صورت گرفت. حضور و عدم حضور باند در هر نمونه مورد بررسی، به صورت یک و صفر امتیازدهی گردید. شاخص - polymorphism information content - PIC که نشان دهنده ارزش هر نشانگر براي بیان چند شکلی در نمونه هاي مورد بررسی است برآورد گردید. همچنین تعداد آلل مشاهده شده براي هر نشانگر، هتروزیگوتی مورد انتظار و مشاهده شده تعیین و در نهایت داده ها با استفاده از نرم افزار NTSYS-pc تجزیه و تحلیل شد و درخت فیلوژنتیکی مناسب رسم گردید.
جدول-1 لیست ارقام گلابی مورد استفاده در این تحقیق
نتایج و بحث
در این تحقیق از 28 نشانگر SSRs براي ارزیابی 47 نمونه گلابی استفاده شد که در مجموع 174 آلل شناسایی و به طور میانگین 6/21 آلل براي هر نشانگر ثبت شد که نشانگر TsuENH014 و TsuENH046 داراي کمترین آلل 3 - آلل - و نشانگر NB103a بیشترین آلل 12 - آلل - در بین آغازگر هاي مورد استفاده بود. میانگین تعداد آلل به دست آمده در هر ژنوتیپ با استفاده از همه نشانگرها 49/3 آلل بود. اندازه قطعات تکثیر شده از جفت آغازگرهاي متفاوت در گلابی در همان دامنه اي کهقبلاًگزارش داده شده بود، قرار داشت.
در این مطالعه اندازه قطعات بین 81 bp تا 245 bp متغیر بود. تعداد آلل هاي تکثیر شده از مکان هاي ژنی تأثیر مستقیمی بر میزان هتروزیگوسیتی، فراوانی ژنوتیپی و محتواي اطلاعات چند شکلی آن ریزماهواره دارد. با بالا رفتن تعداد آلل تکثیر شده در یک مکان، میزان اطلاع رسانی آن مکان براي تعیین تنوع ارقام افزایش می یابد. هتروزیگوتی مشاهده شده از 0/17 در نشانگر TsuENH006 تا 0/96 در نشانگر NB103a متغیر بود - شکل . - 1 گلابی یک گیاه دائمی دگرگشن است لذا این نسبت بالاي هتروزیگوسیتی با طبیعت خود ناسازگاري گلابی که سبب افزایش هتروزیگوسیتی در آن می شود، مطابقت دارد.
