بخشی از مقاله
چکیده:
مورینگاسه تیره کوچکی از گیاهان گلدار جداگلبرگ وشامل منحصرا یک جنس به نام مورینگا است مورینگا شامل معدودي از انواع گیاهان درختی وعلفی است وکاربردهاي بسیاري براي این گیاه بیان شده است. تمامی قسمتهاي این گیاه در زمینه ي داروئی و صنعتی به شکل سنتی مورد استفاده قرار گرفته است; مهمترین کاربرد استفاده ازاین گیاه دانه هاي پودر شده و برگهاي آن است که به عنوان تصفیه کننده آب مورد توجه قرار گرفته و باعث می شود بسیاري از باکتري ها و املاح آب تصفیه شود.
معروفترین گونه ي این خانواده Moringa oleifera است . مطالعات اولیه بر روي گیاه M.oleifera نشان داد که این گیاه داراي مولکولهاي فعال از نوع پپتید هاي کاتیونی محلول در آب با وزن مولکولی 6-16 KDa هستند.یکی ازاین پپپتیدهاMO1,2 است که داراي خاصیت تصفیه کنندگی می باشد . DNAاین پروتئین که 200bp اندازه دارد درE.coliکلون شده و پس از تعیین فعالیت این پروتئین در آب صحت خاصیت تصفیه کنندگی پروتئینMO1,2 به تایید رسید.
Moringa peregrina گونه دیگري ازمورینگا است. در این گونه بومی ایران است .
در این آزمایش برگهاي سبز Moringa peregrina استریل شده و در محیط کشت MS قرار داده شدند از این برگها با تنظیم میزان هورمونهاي رشد کالوس ایجاد شد.کالوسها در نیتروزن مایع با هاون خرد شده وبا استفاده ازکیت استخراجmRNA RNAاستخراج گردید .سپس به وسیله RT-PCR و پرایمرهاي الیگو cDNA dT تهیه شد. با استفاده از پرایمرهاي طراحی شده انجام PCR ژنهاي احتمالی تصفیه کننده آب صورت گرفت. توالی هاي حاصل از
PCR با واردشدن به پلاسمید pTZ57 RT درون باکتریها يE.coli کلون شدند.توالی ها توالی یابی شدند
وسه ژن بدست آمد.
مقدمه:
مورینگاسه خانواده کوچکی از گیاهان گلدار جداگلبرگ وشامل تنها یک جنس به نام مورینگااست مورینگا شامل
معدودي انواع گیاه درختی وعلفی است.این گونه غالبا در نواحی گرم مانند عربستان هند و برمه و.....پراکنده اند در ایران درشیراز سیستان و بلوچستان و......... مشاهده شده است.
از مشخصات آنها این است که داراي برگهاي شانه اي مضاعف مرکب با برگچه هاي کوچک و متقابل و گلهایی با اجزاي 5 قسمتی هستند.میوه آنها بصورت کپسول - پوشینه - دراز ونیام مانند محتوي دانه هاي درشت با جنین راست و مجاري لیزوژن است .مجاوري ترشحی برخی از گونههاي این خانواده انواع دارو و صمغ تولید مینمایند. .حدود 13 گونه از درخت مورینگا در این خانواده وجود دارد معروفترین گونه این خانواده Moringa oleifera است که تمام قسمتهاي این گیاه خوراکی است و از زمانهاي قدیم مورد مصرف انسانها بوده است .
کاربردهاي بسیاري براي این گیاه بیان شده وتمامی قسمتهاي آن در زمینه ي داروئی و صنعتی مورد استفاده است از جمله :برگهاي خرد شده این گیاه به عنوان پاك کننده خانگی چوب آن براي تهیه رنگ آبی دانه هاي پودر شده به عنوان تصفیه کننده عسل و عصاره نی شکرو مهمترین کاربرد آن دانه هاي پودر شده و برگها هستند که به عنوان تصفیه کننده آب مورد توجه است و باعث می شود بسیاري از باکتري ها و املاح آب تصفیه شود. بنابراین جایگزین مناسبی براي تصفیه کننده هاي غیر آلی - آلومینیوم - و پلی مرهاي سنتزي سرطان زا است.
Moringa peregrina گونه دیگري از مورینگا است. این گونه بومی آسیا و ایران - شیراز سیستان و بلوچستان - است.
سالانه بیش از 3.5میلیون نفر در اثر بیماریهاي وابسته به آب آشامیدنی جان خود را از دست می دهند %84 آنها کودکان هستند و %98کل این مرگ و میر در کشورهاي جهان سوم رخ می دهد. امروزه براي تصفیه آب از محلولهاي غیر آلی - آلومینیوم و نمکهاي آهکی - وپلی مرهاي سنتزي که به طور مصنوعی ساخته می شود استفاده می کنند.علی رغم اینکه این مواد کمک شایانی به کاهش مرگ و میر وابسته به آب آشامیدنی آلوده انجام داده است اما در کنار این نفع ضرر جبران ناپذیري به همراه دارد از جمله عوارض آن سرطان آلزایمر و.... است.
به این ترتیب باید به دنبال یک تصفیه کننده طبیعی بود تا در کنار تهیه آب آشامیدنی مطلوب اثرات سوءنداشته باشد. یکی از گیاهان دارویی که در این راستا مورد استفاده قرار می گیرد گیاه مورینگا است .وجود پروتئینهاي تصفیه کننده آب موجود در گیاه Moringa سبب اهتمام به تهیه پروتئنهاي تصفیه کننده آب از آنها به روشهاي بیو تکنولوژي شده است.
مطالعات اولیه بر روي گیاه M.oleifera نشان داد که شامل مولکولهاي فعال از نوع پپتید هاي کاتیونی محلول در آب با وزن مولکولی 6-16 KDa هستند.یکی ازاین پپپتیدهاMO1,2 است که داراي خاصیت تصفیه کنندگی می باشد . cDNAاین پروتئین که 200bp - وزن مولکولی آن 6 KDa - اندازه دارد درE.coliکلون شدو پس از تعیین فعالیت این پروتئین در آب صحت خاصیت تصفیه کنندگی پروتئینMO1,2 به تایید رسید.
پپتید کاتیونی دیگري نیز از این گیاه جداسازي و به نام floنامگذاري شده که 8KDaوزن دارد.این پروتئین نیز به وسیله پرایمرهاي طراحی شده از روي توالی هاي MO1,2 شناسایی شده است.
M. peregrina گونه بومی ایران است.به دلیل اینکه در بیشتر مناطق ایران نیاز به آب آشامیدنی تصفیه شده احساس می شود بهره گیري از این گیاه بومی می تواند کمک شایانی در جهت تهیه آب آشامیدنی تصفیه داشته باشد.
مواد و روشها:
براي تعیین وجود ژنهاي تصفیه کننده درگیاه Moringa peregrina ابتدا برگهاي تازه این گیاه استریل شده و در محیط کشت MS قرار داده می شوداز این برگها با تنظیم میزان هورمونهاي رشد کالوس ایجاد می شود.کالوسها در نیتروزن مایع با هاون خرد شده و با استفاده از کیت استخراج “PLANT Rneasy kit” - QIAGEN - RNA poly-A RNA ها جداسازي شد. سپس poly-A RNA ها به وسیله RT-PCR و پرایمر هاي Oligo dT به cDNA تبدیل شد این عمل به وسیله کیت “RevertAidTM First strand cDNA synthesis kit” - Fermentas - انجام گرفت.
باتوجه به توالی درج شده ژن MO1,2 گیاه M.oleifera در سایتNCBI وبا استفاده ازبرنامه طراحی پرایمر oligo پرایمرهاي forwardو reverse براي انجام PCR ژنهاي احتمالی تصفیه کننده آب طراحی شدند . cDNAهادر PCR به وسیله پرایمر - 5́–CAG GGA CCT GGT CGG CAG CCG GAC TTT CAG- forward 3́ - و پرایمر - 5́- TTA GGT GCT AGG TAT ATT GGA TGC CAC TCG GTA -3́ - reverse با شرایط 94oC ,30 s;36 oC,30s;72oC,1 min; طی 30 سیکل زیاد شدند.
باند هاي حاصل از PCR با واردشدن به پلاسمیدpTZ57R/T که داراي سیستم T/A کلونینگ وجایگاه برشی براي آنزیمهاي sac1/sma1است در باکتریهاي Escherichia coli XL1 blue کلون شدند.این کار به وسیله کیت کلونینگ " InsTAcloneTM PCR cloning kit” - Fermentas - انجام گرفت و به مدت یک شبانه روز در دماي 37 درجه نگهداري شد تا باکتریهاي نوترکیب بیشتري بدست آمد.
نتایج و بحث:
کالوسها در نیتروزن مایع با هاون خرد شده و با استفاده از کیت استخراج poly-A RNA RNA ها جداسازي شد.
تصویر1 نمایشی از استخراج است 1.وRNA - 2هایی است که به روش سنتی استخراج شده اند RNA - 3. هایی است که به وسیله شستشوي اولیه فیلترهاي ویال کیت استخراج “PLANT Rneasy kit” - QIAGEN - - Elute1 - RNA بدست آمده. - 4 RNAهایی است که به وسیله شستشوي ثانویه فیلترهاي ویال کیت استخراج “PLANT Rneasy kit” - QIAGEN - - Elute2 - RNA بدست آمده. سپس poly-A RNA ها از Elute1 به وسیله RT-PCR و پرایمر هاي Oligo dT به cDNA تبدیل شد
