بخشی از مقاله
چکیده :
هدف این مطالعه ، بررسی مولکولی ژن هاي TEM ، در سویه هاي E.coli جدا شده از عفونت هاي ادراري و تعیین الگوي مقاومت انتی بیوتیکی بود . تعداد 100 سویه باکتري اشریشیاکلی از نمونه هاي ادراري جدا شد. حساسیت انتی بیوتیکی با روش انتشار دیسک طبق توصیه CLSI نسبت به 14 انتی بیوتیک تعیین گردید. تولید آنزیم هاي ESBL با استفاده تست Combined disk وبا آنتی بیوتیک CAZهمراه کلاونیک اسید تعیین گردید.سرانجام حضور ژن blaTEMبا استفاده از پرایمر توسط PCR شناسایی شد سویه هاي اشریشیاکلی به اکثر آنتی بیوتیک ها مقاوم بودند میزان مقاومت سویه ها ي جدا شده به آنتی بیوتیک هاي سفالوتین %81 ،سفتر یاکسون%29 ، پنی سیلین %100،اسفازولین %52، سفتازیدیم %30،سفالکسین%49 ،سفتاکسیم%31،سیپروفلوکسین %28،تریکومتوکسازول %48، جنتامایسن %16 ،اریترمایسین %93، ایمی پنم%23 آمیکاسین %19، آموکسیلین %81 بدست آمد در تست Combined disk افزایش اندازه هاله رشد به اندازه mm 5 نسبت به سفتازیدیم در ترکیب آن با کلاونیک اسید نشان دهنده آنزیم BLESبود دراین تست 40Combined disk سویه - %40 - تولید کننده آنزیم ESBL بودند . و نتایج اکنش PCR نشان داد که 20 - % 52/5 سویه - از سویه ها ي ESBLمثبت داراي کد کننده آنزیم TEM بودند نتایج ما نشان می دهد که تولید آنزیم هاي ESBL وفراوانی آنزیم TEMدر سویه هاي مورد مطالعه بالاست بایستی در درمان روش هاي مناسبی اتخاذ گرددتا ازگسترش وانتقال ژن هاي مقاوم جلوگیري شود.
واژگان کلیدي : بتالاکتاماز، اشریشیاکلی، .TEM
مقدمه
اشریشیاکلی فراوان ترین عامل عفونت هاي ادراري می باشد وبعد از باکتروئیدز دومین باکتري از لحاظ فراوانی در روده است - - 1 اشریشیاکلی یکی از باکتري هاي است که قادربه تولید آنزیم بتالاکتاماز وسیع الطیف می باشد - 2 - مکانیسم مقاومت باکتري ها در برابر آنتی بیوتیک ها متفاوت است یکی ازروش هاي مقاومت باکتري ها تولید بتالاکتاماز است - ESBL - 3 از بتالاکتاماز هاي کلاسA بوده که سفالو سپورین هاي وسیع الطیف با یک زنجیره جانبی اکسیمینو - - oximino را هیدرولیز میکنند و باعث بروز مقاومت باکتریایی به پنی سیلین ها سفالسپورین نسل اول، نسل دوم، نسل سوم و ازترئونام بجز سفامایسین یا کارباپنم می شوند و توسط مهارکنندههاي بتالاکتاماز مانند کلاونیک اسید مهار ودر اشریشاکلی شناسایی شدند - . - 4-7
یکی از مهم ترین بتالاکتامازهاي پلاسمیدي در باکتريهاي خانواده انتروباکتریاسه و از علل مهم بروز مقاومت هاي چند دارویی در عفونت هاي بیمارستانی می باشند. بتالاکتامازهاي که توسط پلاسمید کدشده و یک مقاومت چند دارویی را نسبت به بتالاکتام ها از جمله سفالوسپورین هاي نسل سوم و مونوباکتام ها ایجاد میکنند.TEM اولین ESBL شناسایی شده می باشد که به طور وسیع در خانواده انتروباکتریاسه گسترش یافته و به عنوان رایج ترین بتالاکتاماز شناخته می شود که حتی به هموفیلوس آنفولانزا و نیسریا گنوره انتقال یافته است . - 8 - هدف ازاین مطالعه بررسی فراوانی اشریشیاکلی تولید کننده ESBL وشناسایی مولکولی ژن TEMتوسط PCRدر باکتري هاي اشریشیاکلی جداشده از نمونه هاي ادراري شهر ایلام بود.
مواد وروش
در این مطالعه تعداد 100 ایزوله باکتري اشریشیاکلی از نمونه هاي ادراري - بیمارستان امام خمینی و مصطفی خمینی و5 آزمایشگاه طبی در سطح شهر ایلام - جمع اوري شد و با تست هاي بیوشیمیایی تایید شد.ند حساسیت آنتی بیوتیکی سویه ها با روش انتشار دیسک - Kirby-Bauer - طبق توصیه CLSI نسبت به 14 آانتی بیوتیک که شامل آنتی بیوتیک هاي : سفالوتین 30 میکرو گرم - - CF ٫ سفتریاکسون 30 میکروگرم - CRO - ٫ سفوتاکسیم30 میکرو گرم - CTX - ٫پنی سیلین10 میکرو گرم - - P ٫سفازولین30 میکرو گرم - - CZ ٫سفتازیدیم 30 میکرو گرم - - CAZ٫سفالکسین 30 میکرو گرم - - CN ٫سیپروفلوکساسین5میکرو گرم - CP - ٫تریکومتاکسازول30 میکرو گرم SXT - - ٫ جنتامایسین10 میکرو گرم - GM - ٫اریترومایسین 15 میکروگرم ERY - - ٫ایمی پنم10 میکرو گرم - - IPM ٫آمیکاسین30 میکرو گرم - AN - ٫آموکسی سیلین30 میکرو گرم - AM - تعیین گردید.
از سویه اشریشیاکلی استاندار ATCC 25722جهت کنترل روش هاي آنتی بیوگرام استفاده شد . تعیین حداقل روش غلظت مهار کنندگی - Minimum Inhibitory cnentratio MIC - نیز به صورت رقیق سازي آگار نسبت به سفتازیدیم انجام شد براي انجام ازمایش غلظت ها 0/5تا 0/0156میکرو گرم بر میلی لیتر براي این آنتی بیوتیک ها تهیه گردید نتایج این آزمایش در جدول1 نشان داده شده است .جهت بررسی بتالاکتامازهاي وسیع الطیف با روش Combined dickبا استفاده از دیسک هاي سفتازیدیم وسفتازیدیم +کلاونیک اسید مورد مطالعه قرارگرفت تولید ESBLاز طریق افزایش قطر هاله به اندازه 5 mm یا بیشتر در اطراف دیسک سفتازیدیم – کلاونیک اسید مشخص گردید - - 9جداسازي واستخراج DNA باکتري به روش جوشاندن اانجام شد بر اي این منظور دو تا سه تا کلنی از باکتري را در 500 میکرو لیتر آب دیونیزه استریل درون میکروتیوپ حل کرده سپس نمونه ها به مدت 15 دقیقه در 100 درجه سیلیسوس جوشانده وبه مدت 10 دقیقه در 14000 دور سانتریفوژ گردید نجام و میکرو لیتر از فاز رویی پس از اتجام آنالیز هاي کیفی وکمی به عنوان DNAالگو براي واکنش PCRمورد استفاده قرار گرفت - - - 10
بررسی فراوانی ژن بتالاکتاماز TEM با استفاده از پرایمر و دماهاي ذکر شده در جدول 2و3 انجام گردید 5 میکرولیتر از DNA استخراج شده به PCR Master mix با حجم نهایی 25 میکرو لیتر - هر ویال حاوي 1 میکرولیتر - Mgcl2از استوك 50 میلی مول - 2 میکرولیتر بافر 2 . 10X میکرولیتر dNTP از استوك 10 میلی مول 1 - میکرولیتر از هر پرایمر - 0 mix 1primer پیکومول - 1 میکرولیتر آنزیم Taq Polymeraseو 13 میکرو لیتر آب اضافه گردید واز مارکر 250 - ladder - - سیناژن - جهت تایید وزن مولکولی محصولات تکثیر شده در واکنش زنجیره اي پلیمراز استفاده ونتایج بااستفاده از لکتروفورز در ژل اگارز 1در صد بررسی شد.
