بخشی از مقاله
چکیده
گندم دوروم یک گیاه حساس به تنش شوری است که تولید آن تحت تاثیر این تنش قرار میگیرد. در گندم دوروم - الین - 141 ژن Nax1 شناسایی گردید. مطالعات نشان داد که وجود این ژن باعث اعطای تحمل به تنش شوری به گندمهای دوروم و نان میشود. به همین دلیل این ژن میتواند در برنامههای اصالحی خیلی مفید باشد. برای استفاده تجاری از این ژن نیاز به یک نشانگر کامال اختصاصی است. یک نشانگر کامال اختصاصی RFLP-PCR در اواخر سال 2001 توسعه یافت. در این تحقیق با استفاده از این نشانگر گندمهای وحشی ایران که حاوی این ژن هستند غربال شدند. در این تحقیق 4 ژنوتیپ مختلف که حاوی ژن کارکردی Nax1 بودند شناسایی گردیدند.
مقدمه
تحمل به شوری در گندم هگزاپلویید به توانایی دفع Na+ ارتباط دارد که این امر باعث میشود تا غلظتهای باالی Na+ در برگها به خصوص در پهنک برگ اتفاق نیفتد - مونز 2002، الچلی . - 1194 غلظتهای باالی Na+ باعث پیری زودرس و از دست رفتن فعالیت فتوسنتزی میشود - جیمز و همکاران - 2002، که این امر باعث کاهش سرعت آسیمیالسیون کربن و در نهایت کاهش عملکرد دانه میگردد - حسین و همکاران . - 2002 گندم دوروم نسبت به گندم هگزاپلویید خیلی حساستر است، که دلیل آن توانایی پایین گندم دوروم در دفع Na+ از پهنک برگ است - گورهام و همکاران . - 1110 یک منبع غیر عادی از دفع Na+ در گندم دوروم الین 141 یافت شد - مونز و همکاران . - 2000 الین 141 حاصل تالقی بین گندم دیپلویید Triticum monococcum با گندم دوروم ماراکوی است.
در استرالیا غربال تعداد زیادی از ژنوتیپهای خویشاوند گندم دوروم برای تجمع Na+ در پهنک برگ نشان داد که الین 141 شبیه گندم هگزاپلویید حاوی غلظت پایینی از Na+ در پهنک برگ خود است - مونز و همکاران . - 2000 به هر حال غلظت Na+ در کل قسمت هوایی مثل گندم نان در سطح پایینی قرار نداشت - حسین و همکاران - 2004 که این امر پیشنهاد میکرد که Na+ در غالف برگ جمع میشود. در یک آزمایش داونپورت و همکاران - 2002 - ، الین 141 و گندم دوروم تاماروی - گندم دوروم حساس به شوری - را از لحاظ انتقال Na+ و تجمع خالص Na+ با هم مقایسه کردند.
تفاوتهای اصلی بین این دو ژنوتیپ یکی در سرعت انتقال به قسمتهای هوایی - بارگیری خالص آوند چوبی ریشه - بود و دیگری در تجمع ترجیحی Na+ در غالف برگ به جای پهنک برگ است - داونپورت و همکاران . - 2002 آنالیز ژنتیکی تالقی بین الین 141 و تاماروی، دو ژن با اثرات اصلی را برای دفع Na+ نشان داد - مونز و همکاران . - 2002 یک QTL برای غلظت پایین Na+ در پهنک برگ در ناحیهء انتهایی روی بازوی بزرگ کروموزوم 2A نقشه یابی شد و Nax1 نامگذاری گردید - لیندسی و همکاران . - 2004 الزم به ذکر است که منشا ژن Nax1 گندم دیپلویید Triticum monococcum است و این ژن کارکردی در گندمهای زراعی دوروم و هگزاپلویید وجود ندارد.
الین های حاوی Nax1، سدیم را با سرعت پایینی از ریشهها به قسمتهای هوایی نسبت به الینهای ایزوژنیکشان که فاقد آن است، منتقل میکرد، که این ویژگی به خاطر سرعت پایینتر بارگیری خالص آوند چوبی است نه به خاطر سرعتهای پایینتر جذب خالص از خاک یا سرعتهای باالتر جابه جایی مجدد در آوند آبکش. هم چنین Nax1 از طریق وجود غلظتهای باالتر Na+ در غالف برگ نسبت به پهنک برگ متمایز می شود. همهء الینهای فاقد Nax1 دارای غلظتهای مشابهی از Na+ در پهنک و غالف برگ هستند. Nax1 بر روی کروموزوم 2AL نقشه یابی گردید. هانگ و همکاران از توالی ژنوم برنج - Oriza sativa - و داده های حاصل از پروژه نقشه یابی EST گندم برای شناسایی نشانگرها و ساخت یک نقشه با تفکیک پذیری باال از مکان Nax1 استفاده کردند.
دو ژن ترانسپورتر سدیم معروف - TmHKT7 - مرتبط با OsHKT7 بر روی کروموزوم 2AL نقشه یابی شد. یک عضو - TmHKT7-A1 - TmHKT7 بین الینهای حساس و متحمل به تنش چندشکل بود و با Nax1 بطور همزمان تفرق پیدا کرده بود. عضو دیگر - TmHKT7-A2 - TmHKT7 درون کانتیگ مشابهی از کروموزوم مصنوعی باکتریایی و با فاصله تقریبی 142 کیلو باز نسبت به TmHKT7-A1 قرار گرفته است. TmHKT7-A1 و 92 A2 درصد تشابه اسیدآمینه ای دارند. با این حال، TmHKT7-A2 نه A1 در ریشه ها و غالف برگ الین 141 - گندم دوروم متحمل به تنش شوری - بیان گردید.
الگوی بیانی TmHKT7-A2 با نقش فیزیولوژیکی Nax1 در کاستن از غلظت یون سدیم در پهنک برگ و حفظ آنها در غالف برگ سازگار بود - هانگ و همکاران . - 2002 با استفاده از کتاب خانه کروموزومی مصنوعی باکتریایی، توالی ژنهای TmHKT7-A1 و A2 مشخص گردید. قالب قرائت آزاد - ORF - پیش بینی شده برای ژن 1212 - TmHKT7-A1 جفت باز - با دو اینترون دارای 99 درصد تشابه با قالب قرائت آزاد - ORF - پیش بینی شده برای ژن 1222 - TmHKT7-A2 جفت باز - با یک اینترون است - هانگ و همکاران . - 2002
به دلیل کارایی باالی ژنNax1 در اعطای تحمل به تنش شوری در اواخر سال 2001 یک نشانگر کامال اختصاصی RFLP-PCR برای ژن Nax1 توسط اینجانب و زیر نظر پروفسور رانا مونز طراحی گردید - داده ها در آستانه انتشار هستند - . با استفاده از این نشانگر میتوان تمام گندمهای وحشی و زراعی را از نظر این ژن غربال کرد. در این تحقیق گندمهای وحشی دیپلویید ایران - Triticum boeoticum - ، با استفاده از این نشانگر غربال خواهند شد و ژنوتیپهای شناسایی شده که حاوی این ژن هستند در مطالعات اصالحی و ژنتیکی بعدی مورد استفاده قرار خواهند گرفت.
مواد و روشها
استخراج DNA از برگ 22 نمونه گندم دیپلویید T. boeaeoticum صورت گرفت. با استفاده از ترکیب پرایمری EX2F2/UTRR1 قطعه مورد نظر از ژن Nax1 تکثیر گردید. سپس محصول PCR با استفاده از آنزیم Sml1 مورد هضم آنزیمی قرار گرفت که بر اساس الگوی هضمی بوجود آمده ژنوتیپها را از نظر وجود و یا عدم وجود ژنNax1 غربال گردیدند.
نتایج
در تحقیقاتی که رانا مونز و همکاران انجام داده بودند مشخص شده بود که ژن کارکردی Nax1 در ارقام زراعی دوروم و نان وجود ندارد و ژن کارکردی Nax1 در بین ژنوتیپهای دیپلوئید T. boeoticum، T. urartu و T. monocccum یافت میشود. در این تحقیق 22 توده مختلف از گندمهای دیپلوئید Triticum boeoticum منطقه غرب و شمال غرب کشور جمع آوری گردید. DNA ژنومی این جمعیتهای دیپلوئید استخراج گردید و سپس با استفاده از ترکیب پرایمری EX2F2/UTRR1 عمل PCR صورت گرفت و در نهایت برای مشخص کردن ژنوتیپهای دارنده ژن کارکردی Nax1 عمل هضم آنزیمی با استفاده از آنزیم Sml1 صورت گرفت.
قطعه تکثیر یافته 222 جفت باز طول دارد، در صورتی که بعد از هضم با آنزیم Sml1 دو قطعه 229 و 129 جفت بازی حاصل شوند، آن ژن، ژن کارکردی Nax1 خواهد بود و در صورتیکه سه قطعه با اندازه های 202، 172 و 122 جفت باز حاصل شوند، نشاندهنده عدم وجود ژن کارکردی Nax1 خواهد بود - شکل . - 2 همانطور که در شکل 2 نیز مشخص است ژل آگارز نتوانسته است قطعات 172 و 122 جفت بازی را از هم تفکیک کند ولی با این حال میتوان براحتی ژنهای کارکردی Nax1 را از ژنهای غیر کارکردی جدا کرد.
از بین 22 توده مختلف از گندمهای وحشی الگوی باندی 4 ژنوتیپ مختلف نشاندهنده وجود ژن کارکردی Nax1 بود. از این ژنوتیپها در برنامه های آتی برای جداسازی و کلون کردن ژن Nax1 استفاده خواهد گردید. البته تالشهایی را هم برای انتقال این ژن به ارقام ایرانی دوروم و نان صورت خواهد گردید که در آینده-ای نزدیک مطرح خواهند شد. شکل - 2 شناسایی ژن کارکردی .Nax1 ژن کارکردی بعد از هضم با آنزیم Sml1 دو قطعه 229 و 129 جفت بازی تولید می کند در صورتیکه ژن غیر کارکردی سه قطعه با اندازه های 202، 172 و 122 جفت باز تولید می کند.
