بخشی از مقاله
چکیده
کلزا از مهمترین گیاهان دانه روغنی کشور محسوب میشود که عوامل بیماریزای مختلفی باعث کاهش عملکرد آن میشوند. شیوع سه ویروس موزاییک شلغم - Turnip mosaic virus, TuMV - ، ویروس موزاییک کلم گل - Cauliflower mosaic virus, CaMV - و ویروس زردی غربی چغندرقند - Beet western yellow virus, BWYV - از مزارع کلزای کشور به طور گسترده گزارش شده است. از این جهت ایجاد یک لاین مقاوم کلزا از طریق خاموشی آر ان آ و القای بیان یک آر ان ای سنجاقسری که بتواند در برابر هر سه ویروس از مقاومت قابل توجهی برخوردار باشد اهمیت دارد.
بدین منظور توالیهای نوکلئوتیدی از ژنوم سه ویروس مذکور، از بانک ژنی دریافت شد. سپس به منظور شناسایی مناطق حفاظت شده، برای هر یک از گونهها همردیف سازی توالی نوکلئوتیدی ژن CP با استفاده از برنامه MEGA5 انجام شد. توالی150 نوکلئوتیدی از مناطق حفاظت شده این ژن از ویروسهای موزاییک شلغم - از نوکلئوتید شماره 787 تا - 937، ویروس موزاییک کلمگل - از نوکلئوتید شماره 295 تا - 445 و ویروس زردی غربی چغندرقند - از نوکلئوتید شماره 87 تا - 237 انتخاب و پس از قرارگیری در کنار یکدیگر یک توالی 450 نوکلئوتیدی به دست آمد.
جهت بررسی عدم امکان خاموشی آرانآهای میزبان توالی ترکیبی با استفاده از اطلاعات سایت siRNA Scan مورد بررسی قرار گرفت. سپس پیشبینی امکان همسانهسازی آن در یک ناقل دوگانه مناسب با استفاده برنامه Vector NTI version 8.0 انجام شد. درنهایت امکان بیان ساختار آرانای سنجاقسری با استفاده از برنامه RNA structure و سایت RNAfold مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج مطالعات بیوانفورماتیکی این پژوهش پیشبینی کرد که قابلیت بیان آر ان ای سنجاق سری پس از همسانهسازی در حامل مناسب و انتقال به کلزا در شرایط آزمایشگاهی وجود دارد.
-1 مقدمه
کلزا - Brassica napus L. - به عنوان سومین منبع تولید روغن گیاهی در دنیا پس از سویا و پالم روغنی از نظر میزان تولید اهمیت دارد و پس از آن روغنهای آفتاب گردان، بادام زمینی و بذر پنبه در رتبههای بعدی قرار دارند. روغن کلزا به دلیل برخورداری از میزان پایین اسیداوریک به عنوان منبع ارزشمند روغن در تغذیه اهمیت دارد
بیمارگرهای متعددی کلزا - Brassica napus L. - را آلوده میکنند و سبب خسارت به این محصول دانه روغنی میشوند. سه گونه ویروس به نامهای ویروس موزاییک شلغم Turnip mosaic virus - TuMV - ، ویروس موزاییک کلمگل Cauliflower mosaic virus - CaMV - و ویروس موزاییک غربی چغندرقند Beet western yellow virus - BWYV - از ویروسهای شایع مزارع کلزا در ایران میباشند
ویروس موزاییک شلغم متعلق به جنس Potyvirus و خانواده Potyviridae که گیاهان خانواده چلیپائیان را آلوده میکند و ژنوم آن از نوع - + - ssRNA میباشد . [7,6] حداقل 89 گونه شته از جمله شته سبز هلو - Myzus persicae - و شته مومی کلم - Brevicoryne brassica - به روش ناپایا این ویروس را منتقل میکنند
ویروس موزاییک کلم گل متعلق به جنس Caulimovirus و خانواده Caulimoviridae میباشد که یکی دیگر از عوامل بیماریزا در خانواده چلیپائیان میباشد که توسط شتهها به روش ناپایا منتقل میشود و ژنوم آن از نوع ssDNA است .[9,6] ویروس زردی غربی چغندرقند متعلق به جنس Polerovirus و خانواده Luteoviridae با دامنه میزبانی وسیع میباشد و ژنوم آن از نوع - + - ssRNA است .[6] این ویروس توسط شتههای مختلفی انتقال مییابد اما ناقل کارای این ویروس شته سبز هلو است که به روش پایا و غیرتکثیری ویروس را منتقل میکند
ازآنجاییکه امکان رقمی از کلزا که بتواند در برابر هر سه ویروس مقاومت خوبی داشته باشد وجود ندارد و از طرفی دیگر نیز آلودگی همزمان گیاه به چند ویروس می تواند باعث افزایش شدت علایم بیماری در مقایسه با آلودگی انفرادی آنها شود بنابراین هدف از انجام این پژوهش بررسی بیوانفورماتیکی امکان طراحی یک سازه مناسب با هدف ایجاد مقاومت لاینی از کلزا از طریق مکانیسم خاموشی آر ان آ در برابر هر سه ویروس مذکور باشد.
-2 مواد و روشها
-2-1 انتخاب توالی هدف در ژنهای CP و HC-Pro
از آنجاییکه تعداد محدودی از توالیهای مربوط به ژن CP در جدایههای TuMV، CaMV و BWYV مناطق مختلف ایران در بانک ژنی NCBI به ثبت رسیده است لذا از اطلاعات مربوط به این توالیها و همچنین سایر جدایههای سایر مناطق دنیا جهت همردیف سازی توالیها به منظور شناسایی مناطق حفاظت شده استفاده گردید و 150 نوکلئوتید از نواحی که بیشترین منطقه حفاظت شده را شامل شدند به عنوان توالی هدف خاموشی کاندید شدند. به منظور همردیف سازی توالیها از برنامه MEGA5 استفاده شد.
-2-2 شبیهسازی همسانهسازی سازه در حامل pFGC5941
جهت همسانهسازی سازه طراحی شده استفاده ازحامل pFGC5941 پیشنهاد میشود که مناسب جهت بیان آر ان آهای سنجاقسری و القای خاموشی آر ان آ در گیاهان میباشد. بدین منظور پس از طراحی چهار سایت برشی و قرارگیری سه توالی 150 نوکلئوتیدی منتخب، سازه 450 نوکلئوتیدی به همراه چهار سایت برشی و نوکلوتیدهای لنگر، شبیهسازی همسانهسازی آن در حامل pFGC5941 با استفاده از برنامه Vector NTI version 8.0 انجام گرفت.
-2-3 پیش بینی ساختار ثانویه آر ان آ
پیشبینی امکان تشکیل ساختار آر ان ای سنجاقسری پس از انتقال حامل همسانهسازی شده حاوی سازه طراحی شده به میزبان، توسط برنامه RNA Structure و سایت RNAfold مورد ارزیابی قرار گرفت.
-2-4 بررسی امکان Off Target
پس از انتخاب ناحیهای که بیشترین منطقه حفاظت شده را شامل شد، به منظور حصول اطمینان از عدم مورد هدف قرارگیری توالیهای احتمالی آر ان ای مشابه و siRNAهای احتمالی ایجاد شده که بتوانند آر ان آهای میزبان را خاموش کنند با استفاده از اطلاعات سایت - http://bioinfo2.noble.org/RNAiScan.htm - siRNA Scan بررسی شدند.
-3 نتایج و بحث
-3-1 توالیهای هدف و نقشه سازه طراحی شده
پس از انتخاب توالیهای مورد نظر طراحی و تحت توالی ویروسی تأیید شد.
هدف، با توجه به موقعیت سایتهای برشی - NcoI, BamHI, XmaI, XhoI - در حامل pFGC5941 سازه نام گرفت
