بخشی از مقاله
چکیده:
ژنهای HLA بسیار پلی مورفیسم هستند و رمز کنندهی پروتئینهایی هستند که در پاسخهای ایمنی نقشهای حیاتی دارند. ملکولهای کالس دو HLA ها شامل: DP، DQ و DR هستند که هریک ترکیبی از دو پروتئین آلفا و بتا میباشند. هریک از زنجیرههای آلفا و بتا از طریق ژنهای مجزایی رمز میشوند - به جز زنجیرهی آلفا از لکوس . - DR برای برخی از ژنها در این منطقه هزاران آلل توصیف شده است.
مطالعه بر روی ژنهای HLA اطالعات سودمندی در ارتباط با اهدای مغز استخوان، پزشکی قانونی، اطالعات مرتبط با بیماریها و طراحی واکسن علیه تومورها و بیماریهای خود ایمن میدهد. از آنجا که تعیین ژنوتیپ HLA اهمیت بسزایی در مباحث پیوند و همچنین برخی از بیماریهای مرتبط با سیستم ایمنی دارد، مهم است که بتوان سیستمهای ساده و در عین حال مؤثری را جهت تعیین آللهای آنها طراحی نمود. سیستمهای مبتنی بر PCR اگرچه از دو شرط فوق برخوردارند اما به دلیل پلیمورفیسم بسیار باالی این لکوسها طراحی یک سیستم PCR اختصتصی آللی بمنظور تعیین محتوای آللی این لکوسها مشکل به نظر میرسد.
از اینرو، در این مطالعه روشی برای طراحی پرایمرهای PCR جهت انجام PCR اختصاصی آللی با قابلیت شناسایی گروه آللی DQB1*03 بکار گرفته شد. در این روش، ابتدا توالی بخش اگزونی 2 و 3 از کل آللهای DQB1 از پایگاه دادهای dbMHC اخذ شد. سپس برای هر یک از گروههای آللی این لکوس توالی توافقی بدست آمد، و با همردیفی چندگانهی این توالیهای توافقی، ناحیهی مناسب جهت طراحی پرایمر انتخاب شد. پرایمرهای طراحی شده بمنظور بررسی توانایی تکثیر و بهینه سازی شرایط PCR بر روی DNAی استخراج شده از ردهی سلولی K562 که دارای آلل مورد نظر است آزمایش گردید و نشان داده شد که توانایی تکثیر محصول 154 جفت بازی هدف را دارند. بعالوه نشان داده شد که این پرایمرها، نمونههایی که از قبل میدانستیم فاقد آلل DQB1*03 هستند را تکثیر نمیکنند.
سپس، پرایمرهای طراحی شده، بر روی 128 نمونه از خون افراد مورد بررسی قرار گرفت تا توانایی این سیستم در نمونههای حقیقی نیز مورد بررسی قرار گیرد. بدین منظور، خون افراد در لوله های حاوی اتیلن دیآمین تترا استیک اسید - EDTA - جمع آوری گردید. پس از انتقال خون حاوی EDTA به آزمایشگاه، با استفاده از روش salting out، DNA استخراج گردید. میانگین غلظت DNA استخراج شده ng 40 در میکرولیتر بود. نتایج مطالعه نشان داد که در این 128 نمونهی مورد بررسی، 110 نفر واجد و 58 نفر فاقد آلل مورد نظر بودند. بنابراین 25% افراد این نمونه دارای آللDQB1*03 هستند.
مقدمه:
کمپلکس اصلی سازگاری بافتی - - MHC در مهرهداران قسمتی از ژنوم خواهد بود که از جمله ژنهای بسیار پلی مورفیک هستند و نقش اساسی در بروز پاسخ ایمنی نسبت به آنتیژنهای پروتئینی خواهد داشت و در پیوند یا رد پیوند نقش اساسی ایفا میکنند، به نوع انسانی آن، آنتیژنهای لکوسیتی انسان - - HLA گفته میشود، اینها در بازوی کوتاه کروموزوم 2 واقعشده است.که بر اساس ساختمان بافتی و عملکرد به سه کالس مجزا تقسیم میشوند. ژنهای کالس یک و دو پلیمورف ترین سیستم ژنتیکی در ژنوم انسان هستند، بهطوریکه برخی از لوکسها بیش از صدها آلل خواهند داشت و این تفاوتهای جزئی در توالی - DNA - عامل تنوع ژنتیکی در بین افراد مختلف محسوب میشوند.]2[ در بین این سه کالس، کالس دو موردتوجه ما قرار گرفت به شکلی که، مطالعات نشان میدهد.
مطالعه بر روی پلی مورفیسم HLA برای بررسی علت نامشخص آسیب پذیری بیماری مفید است و همچنین موجب شناسایی پیش زمینه ژنتیکی در جمعیتهای مختلف میشود]3[ به علت فقدان دادههایی در مورد ژنوتایپینگ ملکولی و دشواری مطالعات سرولوژیک در مورد ژن HLA کالس دو در جمعیت نرمال ایرانی مطالعه حاضر به بررسی و طراحی سیستمی مبتنی بر PCR برای بررسی فراوانی ژن DQB1*03 پرداخته است. حساسیت PCR به طور قابل مالحظهای به کارآیی پرایمرها وابسته است. شاید مهمترین پارامتر موفقیت PCR طراحی پرایمر باشد. در شرایط مطلوب، طراحی ضعیف پرایمر میتواند منجر به عدم کارکرد PCR شود.
مواد و روش:
در طی این پژوهش، با توجه به اینکه تعیین زنوتیپ - HLA - اهمیت بسزایی در مباحث پیوند و همچنین برخی از بیماریهای مرتبط با سیستم ایمنی دارد، مهم است که بتوان سیستمهای ساده و درعینحال مؤثری را جهت تعیین آللهای آنها طراحی نمود. سیستمهای مبتنی بر - PCR - اگرچه از دو شرط فوق برخوردارند اما به دلیل پلیمورفیسم بسیار باالی این لوکوسها طراحی یک سیستم - PCR - اختصاصی آللی بهمنظور تعیین محتوای آللی این لکوسها مشکل به نظر میرسد.
ازاینرو، در این مطالعه روشی برای طراحی پرایمرهای - PCR - جهت انجام - PCR - اختصاصی آللی با قابلیت شناسایی گروه آللی - DQB1*03 - بکار گرفته شد. در این روش، ابتدا توالی بخش اگزونی 2 و 3 از کل آللهای - DQB1 - از پایگاه داده - dbMHC - اخذ شد. سپس برای هر یک از گروههای آللی این لکوس توالی توافقی به دست آمد و با همردیفی چندگانهی این توالیهای توافقی، ناحیهی مناسب جهت طراحی پرایمر انتخاب شد.
پرایمرهای طراحیشده به منظور بررسی توانایی تکثیر و بهینهسازی شرایط - PCR - بر روی - DNA - استخراجشده از رده سلولی - K562 - که دارای آلل موردنظر است آزمایش گردید و نشان داده شد که توانایی تکثیر محصول 154 جفت بازی هدف رادارند. بعالوه نشان داده شد که این پرایمرها، نمونههایی که از قبل میدانستیم فاقد آلل - - DQB1هستند را تکثیر نمیکنند. سپس، پرایمرهای طراحیشده، بر روی 128 نمونه از خون افراد موردبررسی قرار گرفت تا توانایی این سیستم در نمونههای حقیقی نیز موردبررسی قرار گیرد بهمنظور تکثیر قطعات از پرایمرهای
forward : GGATTTCGTGTACCAGTTTAAGG
Reverse : TGCAAGGTCGTGCGGAG
استفاده شد و توسط بیوانفورماتیک همردیفی شد و از صحت عملکرد پرایمرها اطمینان حاصل شد. نمایانگر این است که این قطعه در ناحیه ؟ تا ؟ ژن قرار دارد و یک قطعه 154 جفت بازی تکثیر میشود.
DNA استخراج شده توسط روش Salting out استخراج شد و کیفیت، کمیت و خلوص این DNA توسط ژل آگارز %1 سنجیده شد. این قطعات با استفاده از مستر میکس شرکت پیشگام در حجم نهایی 10 با شرایط دمایی زیر تکثیر شدند.
