بخشی از مقاله
چکیده :
متحمل سازي گیاهان زراعی نسبت به علف کش گلیفوسیت از طریق دست ورزي ژنتیکی بهترین روش در کنترل علفهاي هرز مزارع گیاه روغنی کلزا محسوب میشود. گلیفوسیت با مهار آنزیم -5 - EPSPS انول پیرویل شیکیمات- -3 فسفات سنتاز - در مسیر شیکیمات مانع سنتز اسیدهاي آمینه حلقوي و در نتیجه مرگ گیاه میشود. براي توسعه گیاه با سطح تحمل قابل قبول در مقیاس تجاري علاوه بر دست ورزي آنزیم EPSPS، به کار گیري ژنهاي مربوط به آنزیمهاي تجزیه کننده گلیفوسیت نظیر - GOX گلیفوسیت اکسیدورداکتاز - نیز ضروري میباشد.
این آنزیم علف کش را به ترکیباتی که اثر کشندگی کمتري براي گیاه دارد تبدیل میکند. در این راستا، با کمک نرم افزارهاي مختلف رایانه اي براي افزایش کارایی بیان ژن در گیاه رمزهاي ژن gox متناسب با گیاه کلزا بهینه گردید. همچنین درصد GC آن کاهش داده شد، عناصر تنظیمی منفی حذف و توالیهاي مفید براي بیان بالاي ژن در آن تعبیه شد. پس از کلون شدن ژن مصنوعی در وکتور مناسب گیاهی براي انتقال به گیاه در جهت افزایش مقاومت گیاه به گلیفوسیت به کار گرفته شد.
مقدمه :
مهمترین محدودیت کشت گیاه روغنی کلزا با نام علمی Brassica napus L. رشد بی رویه علفهاي هرز در مزارع آن میباشد. استفاده از علف کش وسیع الطیف و موثر گلیفوسیت1 روش مناسبی براي مبارزه با این آفات به شمار میرود، اما تاثیر منفی علف کش بر روي گیاه زراعی که خود از گیاهان وحشی منشعب شده، استفاده از آن را مشکل ساز نموده است؛ لذا استفاده از روشهاي کلاسیک و مبتنی بر مهندسی ژنتیک براي مقاوم نمودن گیاه به علفکش ضروري است
این علف کش از طریق ممانعت از عملکرد آنزیم -5 - EPSPS انول پیرویل شیکیمات- -3 فسفات سنتاز؛ - EC 2.5.1.19 در مسیر شیکیمات مانع تولید اسیدآمینههاي آروماتیک میگردد . - 3 - براي ایجاد گیاه مقاوم به گلیفوسیت علاوه بر مطالعه بر روي آنزیم EPSPS و پیدا کردن آنزیم مقاوم به وسیله غربالگري میکروبی و یا ایجاد جهش در آن، استفاده از راه کار بهکارگیري آنزیمهاي تجزیه کننده گلیفوسیت - نظیر - gox هم ضروري به نظر میرسد.
ژن gox به دست آمده از باکتري Ochrobactrum anthropi strain LBAA رمز کننده آنزیم گلیفوسیت اکسیدورداکتاز است که گلیفوسیت را به AMPA - آمینو متیل فسفونیک اسید - و گلی اکسالات تبدیل میکند. AMPA ترکیبی است که قدرت کشندگی کمتري نسبت به گلیفوسیت دارد . - 2, 6 - گیاه مانند هر موجودي رمزهاي ویژه خود را داراست لذا براي بیان مناسب ژن gox در آن بهتر است رمزهاي آن متناسب بارمزهاي ترجیحی2 گیاه کلزا بهینه سازي3 شود.
علاوه بر آن استفاده از توالیهاي غیر ترجمه شونده - 5´UTR - مانند کوزاك - G/ACCACC - 4 سبب میشود که ترجمه از روي mRNA با دقت بیشتري انجام شده و میزان بیان را تا ده برابر افزایش دهد . - 7, 10 - در این بررسی رمزهاي این ترانسژن براي بیان بالا در گیاه کلزا طراحی و بهینه گردید. و توالی تنظیمی کوزاك در انتهاي 5' قبل از رمز شروع قرار داده شد. در نهایت این ژن به صورت مصنوعی ساخته در وکتور مناسب گیاهی قرار داده شد و جهت تراریختی گیاه کلزا براي ایجاد تحمل بیشتر به گلیفوسیت به کار برده شد.
مواد و روشها
بررسیهاي کامپیوتري جهت بهینه سازي و تهیه ژن مصنوعی gox
توالی ژن gox از .U.S patent no.5776760بهدست آمد - 2 - و رمزهاي ژن با استفاده از نرم افزارهاي بیوانفورماتیک،-Stand alone softwares such as Leto - Entelechon, Germany - , DNA 2.0 http://www.dnatwopointo.com، نرم افزار DNAsis MAX - Hitachi Software - ، بانک اطلاعاتی و نرم افزارهاي مختلف codon database http:// www.kazusa.or.jp/codon وSwissprot reverse translation online tool http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html و Gen-Script - NJ, - 1 - USA - متناسب با گیاه بهینه شد. خصوصیات مختلف ژن نظیر توالیهاي تنظیمی5 آن بررسی گردید. همچنین با برنامه RNA mfold به نشانی اینترنتی - http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/rna-form1.cgi - ساختار دوم mRNA ژن مورد نظر بررسی و میزان پایداري آن محاسبه گردید.
تهیه سازه ژنی pBI121-synth-gox
ژن مصنوعی gox سفارش داده شد و پس از تعیین توالی به منظور اطمینان از صحت ترادف آن، درون پلاسمید pUC57 همسانه سازي و به صورت لیوفیلیزه دریافت شد. ژن در وکتور مناسب گیاهی pBI121 به جاي ژن gus در جایگاه برشی آنزیم هاي BamHI و SacI تحت آغازگر CaMV 35S و خاتمه دهنده - nopaline synthase - nos قرار گرفت. این ناقل pBI121-synth-gox نام گذاري شد. ناقل گیاهی همچنین داراي ژن nptII تحت کنترل آغاز گر و خاتمه دهنده nos است؛ این ژن رمز کننده آنزیم نئومایسین فسفوترانسفراز است که براي انتخاب گیاه مقاوم به آنتی بیوتیک کانامایسین به کار میرود.
طراحی آغازگر
جهت انجام آنالیزهاي مولکولی بر روي گیاهان تراریخت، نیاز به تهیه آغازگرهاي مناسب میباشد. براي این کار از نرم افزارهاي Oligo استفاده شد. و خصوصیات توالی آغازگر مانند Tm، ΔG و امکان تشکیل پیوند بین جفت بازها - دایمر و لوپ - بررسی گردید. آغازگرهاي رفت و برگشتی با نامهاي synth-gox-F و synth-gox-R به ترتیب به صورت - 5´-GGATCCACCACCATGTCG-3´ - و - 5´-AGCTCTCAGGAGGCAGGAC -3´ - است، قطعه حاصل از تکثیر شامل 1314bp میباشد.
تراریختی گیاه کلزا
ناقل pBI121-synth-gox با روش استاندارد انجماد و ذوب به اگروباکتریوم تومی فاشینس سویه LBA4404 انتقال داده شد. دمبرگهاي برگهاي لپهاي گیاه کلزا به مدت زمان 40 ثانیه در محیط سوسپانسیون اگروباکتریوم قرار داده شدند. سپس این برگهاي لپهاي در محیط همکشتی MS هورمون دار با اگروباکتریوم - BAP 4 mg/L - کشت داده شدند و به مدت 48 ساعت در تاریکی و دماي 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. سپس گیاهچهها، به محیط انتخابی القاي نوساقه حاوي 15g/L کانامایسین منتقل شدند. پس از سه هفته، ساقههاي سبز تولید شده بر روي محیط انتخابی فوق به محیط ریشه زایی انتقال داده شدند
نتایج و بحث
بررسیهاي رایانه اي جهت بهینه سازي و طراحی ژن مصنوعی
با استفاده از نرم افزارGene Designer رمزهایی ترجیحی گیاه کلزا انتخاب و جایگزین رمزهاي موجود در توالی ژن شد به طوریکه توالی اسیدهاي آمینه تغییر نکرد. در شکل 1 الف هر دو ژن وحشی و مصنوعی از لحاظ رمزهاي تر جیحی مورد بررسی قرار گرفت. این تطابق کدونها با ضریب سازگاري رمز 6 بیان میشود که بالاترین ارزش مقداري آن 100 است که براي بالاترین میزان تکرار یک رمز مربوط به یک اسید آمینه خاص در موجود در نظر گرفته شده است. این مقدار براي ژن مصنوعی در ابتدا 0/57 بوده که بعد از بهینه سازي براي ژن مصنوعی به 0/67 تغییر یافته است.
در شکل 1 ب میزان درصد GC بعد و قبل از بهینه سازي مقایسه شد این مقدار از 56/46 به 53/64 کاهش پیدا کرد. با استفاده از نرم افزارهاي بیوانفورماتیک برخی از خصوصیات دیگراین ژن نظیر نوع و محل برش آنزیماي محدود الاثر نیز مشخص گردید. به طوريکه جایگاه برش براي آنزیم هاي BamHI و SacI که جهت همسانه سازي ژن درون ناقل pBI121 مد نظر بودند، بررسی و حذف شدند.
براي این آنزیمها به ترتیب در انتهاي 5´ و 3´ جایگاه برشی مناسب قرار داده شد. ترادفهاي ناپایدار کننده RNA در سیستم گیاهی مانند وجود جایگاههاي پلیA و پلیT، توالیهاي تنظیمی تکراري مستقیم و معکوس، محل اتصال ریبوزوم7 باکتریایی بررسی و حذف شد. در یوکاریوتهاي عالی، افزودن توالی کوزاك - G/ACCACC - قبل از رمز شروع - ATG - و افزودن نوکلئوتید - C+5 - C پس از رمز شروع، موجب افزایش ده برابري ترجمه و بیان ژن میگردد
براي این منظور این توالی درانتهاي 5' ژن قرار داده شد و پس از رمز شروع، رمز TCG - سرین - بود که نیاز به تغییر نداشت. سپس ساختار دوم mRNA پیشگویی گردید و پایداري ساختار بر اساس میزان حداقل انرژي و عدم داشتن ساختارهاي نامناسب ارزیابی شد. میزان حداقل انرژي این ساختار -431/83 کیلوکالري بر مول میباشد که انرژي قابل قبولی براي پایدارري mRNA به منظور ترجمه در گیاه میباشد. در نهایت سازه ژنی در بانک ژن - gene bank - با Accession number= HQ110097.1 ثبت گردید و جهت ساخت به شرکت Shinegene در کشور چین سفارش داده شد.
شکل :1 بررسی رمزهاي ترجیحی در ژن با منشا باکتریایی و بهینه شده براي بیان در گیاه کلزا. الف. تطابق رمزهاي مختلف در هر جایگاه را نشان می دهد. ب. میزان درصد GC ژن مورد نظر را قبل و بعد از بهینه سازي بیان میکند.
همسانه سازي در ناقل گیاهی و آنالیز کلونها
پس از همسانه سازي قطعه ژنی در ناقل pBI121 و انتقال به باکتري مستعد E. coli DH5α، از باکتريهاي رشد کرده بر روي محیط حاوي آنتی بیوتیک کانامایسین، پلاسمید تخلیص شد و جهت تایید سازه ژنی از روش PCR و هضم آنزیمی استفاده شد - شکل . - 3 بعد از انتقال به اگروباکتریوم، گیاه کلزا تراریخت گردید و سپس گیاهچههاي سبز رشد کرده در محیط گزینشگر حاوي کانامایسین انتخاب و نوساقه هاي سبز پس از طی 21 روز به محیط 200mg/l MS سفوتاکسیم - براي جلوگیري از رشد و حذف باکتري - منتقل شدند و آنالیزهاي بیشتر مولکولی بر روي این گیاهان انجام خواهد شد
شکل :3 تایید سازه ژنی .pBI121-synth-gox چاهک شماره :1 وکتور pBI121، چاهک شماره pBI121-synth-gox :2 ، چاهک شماره 3 برش آنزیمی توسط BamHI و SacI و چاهک شماره :4 تکثیر ژن synth-gox با کمک آغازگرهاي اختصاصی ژن .synth-gox
