بخشی از مقاله
مقدمه
توزیع آلفاتالاسمی در جمعیت هاي متفاوت بسیار متغیر است. بسته به نوع ژنوتیپ، فنوتیپ هاي مختلفی قابل انتظار است که از فرم خفیف تا شدید تعریف شده است.
هدف
این مطالعه براي پاسخ به این سئوال که فرکانس ناقلین آلفاتالاسمی در جمعیت چه میزان است طراحی شده بود. واز آنجاییکه تهران یکی از کلانشهرهاي کشوربوده وبعنوان پایتخت، بیشترین جمعیت مهاجراز اقصی نقاط کشور را دارا می باشد، بعنوان محلی از جمعیت هتروژن انتخاب شد.
روش انجام تحقیق
تعداد 626 نفر از 8 مرکز بهداشتی وابسته به یکی از سه دانشگاه علوم پزشکی در شهرتهران معرفی شدند. بادریافت 10 سی سی خون در ماده ضد انعقاد EDTA که در انجام آزمایشات PCR هیچگونه منعی ایجاد نمی کند و پس از ثبت اطلاعات افراد در برنامه نرم افزاري Access و دریافت رضایتنامه ، آزمایشات مربوطه جهت تخلیص DNA از خون - 1 - ، شروع گردید.
آزمایشات مولکولی مختلف مانند Multiplex Gap PCR و ARMS PCR و در مواردي که میزان پارامتر هاي خونی افراد با پاسخ آزمایشات مولکولی قابل توجیه نبود براي بررسی بیشتر جهت تعیین توالی - Sequencing - ارسال گردیدند. براي تعیین چهار جهش حذفی متداول در ژن آلفا گلوبین -α3.7 - ، -α4.2 ،--20.5 ، - -- MED از روش Multiplex Gap PCR که در بخش پزشکی مولکولی با تغییر در میزان بافرها ونوع آنزیم و تغییر برنامه PCR بهینه گردیده بود استفاده شد.
نتایج
حداقل 1 نوع حذف در ژن آلفا گلوبین در 95 نفر تشخیص داده شد. بر این اساس فراوانی جهش هاي حذفی شایع در افراد مورد بررسی %19/83 بود. . - CI 95%; 11.81%-27.85% - تعداد افراد داراي جهش در ژن آلفا گلوبین در افراد داراي MCV<80 or MCH <27 حداقل 143 نفر و با فراوانی %29/90 باشد. - CI95%; 22.40%-37.40% -
مقدمه
توزیع آلفاتالاسمی در جمعیت هاي متفاوت بسیار متغیر است. بسته به نوع ژنوتیپ، فنوتیپ هاي مختلفی قابل انتظار است که از فرم خفیف تا شدید تعریف شده است.در کشور ما بر اساس نتایج تحقیقات انجام یافته توسط نویسنده گان این تحقیق و سایر محققین ایرانی و خارجی میبایستی جمعیت قابل توجهی داراي این نقص ژنتیکی باشند.
این مطالعه براي پاسخ به این سئوال که فرکانس ناقلین آلفاتالاسمی در جمعیت چه میزان است طراحی شده بود. واز آنجاییکه تهران یکی از کلانشهرهاي کشوربوده وبعنوان پایتخت، بیشترین جمعیت مهاجراز اقصی نقاط کشور را دارا می باشد، بعنوان محلی از جمعیت هتروژن انتخاب شد. بنابراین با انتخاب 8 مرکز بهداشت از مناطق مختلف شهرتهران نمونه هاي خون داوطلبان مراجعه کننده به آن مراکز جمع آوري و به گروه پزشکی مولکولی در انستیتو پاستورایران منتقل گردید.
تعیین دقیق وضعیت فرد از نظر جهش هاي احتمالی برروي ژن آلفاتالاسمی میتواند سردرگمی موجود براي اظهارنظر بر روي جنین زوجهاي مشکوك را به حداقل برساند. اطلاع از فراوانی ناقلین آلفاتالاسمی در جمعیت ومقایسه نتایج پارامترهاي خونی این گروه میتواند به مرور ارزیابی مراجعین مشکوك در مراکز بهداشتی را تسهیل بخشد.
با دریافت نتایج حاصل از آزمایشات خون افراد داوطلب ازدواج که به مراکز بهداشت سطح شهر تهران مراجعه می نمایند، اولا نسبت افرادسالم که براي ازدواج مشکلی ندارندو افراد ناقل مشکوك بدست می آید. با کنار گذاردن نمونه هایی که قطعا نقص بر روي ژن بتا گلوبین دارند میتوان فراوانی آلفاتالاسمی را درجمعیت مورد مطالعه تعیین کرد.
روش انجام تحقیق:
با دریافت 10 سی سی خون در ماده ضد انعقاد EDTA که در انجام آزمایشات PCR هیچگونه منعی ایجاد نمی کند و پس از ثبت اطلاعات افراد در برنامه نرم افزاري Access و دریافت رضایتنامه ، آزمایشات مربوطه جهت تخلیص DNA از خون - 1 - ، شروع گردید و متعاقب آن آزمایشات مولکولی مختلف مانند Multiplex Gap PCR و ARMS PCR و در مواردي که میزان پارامتر هاي خونی افراد با پاسخ آزمایشات مولکولی قابل توجیه نبود براي بررسی بیشتر جهت تعیین توالی - Sequencing - ارسال گردیدند.
براي تعیین چهار جهش حذفی متداول در ژن آلفا گلوبین -α3.7 - ، -α4.2 ،--20.5 ، - -- MED از روش Multiplex Gap PCR که در بخش پزشکی مولکولی با تغییر در میزان بافرها ونوع آنزیم و تغییر برنامه PCR بهینه گردیده بود استفاده شد . - 2,3 - در مورد نمونه هایی که هیچ حذفی را نشان نمیدادند و یا حتی با مشخص شدن نوع جهش حذفی، نوع آن با میزان کاهش پارامترهاي خونی قابل توجیه نبود - عدم تطابق ژنوتیپ با فنوتیپ - این گروه براي انجام آزمایشات تکمیلی دیگر جدا شده و آزمایشات ARMS PCR و نهایتا sequencingروي این نمونه ها انجام گردید.
نتایج:
تعداد 626 نفر از 8 مرکز بهداشتی وابسته به یکی از سه دانشگاه علوم پزشکی در شهرتهران معرفی شدند. براي همه داوطلبان آزمایش CBC انجام شد. تعداد 147 نمونه با در نظر گرفتن پارامترهاي خونی شان براي آلفا تالاسمی نرمال تلقی گردیدند. این افراد مورد آزمایشات مولکولی واقع نشدند زیرا طبق جدول صفحه 479 از کتاب - 4 - " The Thalassemia Syndrome"، بر این اساس داوطلبانی که دراین تحقیق شرکت کردند و داراي میزان MCV بالاي 88 و MCH بالاي 28.5 ویا هموگلوبین بالاي 15.4 بودند براي انجام آزمایشات مولکولی انتخاب نگردیدند و نرمال تلقی شدند.
بررسی مولکولی در بقیه افراد 479 - نمونه - به روش Multiplex Gap PCR براي بررسی حذف هاي شایع انجام شد. حداقل 1 نوع حذف در ژن آلفا گلوبین در 95 نفر تشخیص داده شد. بر این اساس فراوانی جهش هاي حذفی شایع در افراد مورد بررسی %19/83 بود. . - CI 95%; 11.81%-27.85% - همچنین50 نمونه از نمونه هاي فاقد جهش هاي حذفی که داراي پارامترهاي MCV>80 و MCH>27 بودند از نظر وجود تریپلیکیشن در ژن آلفا گلوبین مورد بررسی قرار گرفتند ولی تریپلیکیشن در هیچ نمونه اي یافت نشد.
بر اساس بررسی هاي قبلی - 5 - و با توجه به اینکه با روش Multiplex Gap PCR حدود %65 موارد داراي جهش در ژن آلفا گلوبین در افراد داراي MCV<80 or MCH <27 قابل تشخیص می باشد، به نظر می رسد تعداد واقعی موارد داراي جهش در ژن آلفا گلوبین بیشتر از موارد یافته شده با روش فوق باشد. بر این اساس در صورت تعمیم نتیجه به دست آمده در این مطالعه به جامعه براساس مطالعه قبلی، به نظر می رسد تعداد افراد داراي جهش در ژن آلفا گلوبین در افراد داراي MCV<80 or MCH <27 حداقل 143 نفر و با فراوانی %29/90 باشد . - CI95%; 22.40% -37.40% -
حذف 3/7 کیلوبازي در ژن آلفا گلوبین به صورت هتروزیگوت - α3.7/αα - در 79 نفر از افراد مورد بررسی - %16/49 - یافت شد. فراوانی آللی حذف 3/7 کیلوبازي – بصورت هترو وهموزیگوت- در88 کروموزوم مورد بررسی - % 9/19 - دیده شد. حالت هموزیگوت این جهش در سه نمونه دیده شد که در واقع 0.6 درصد جمعیت مورد مطالعه بود. جهش حذفی مدیترانه اي در سه نمونه و حذف – 20.5 در دو نمونه بصورت هتروزیگوت - فقط در یک کروموزوم - و در یک نمونه نیز بصورت ترانس همراه با موتاسیون –α 3.7 تعیین شد. جهش حذفی –α 4.2 فقط در یک نمونه دیده شد. و یک نمونه هم جهش پلی A تعیین گردید.
بدین ترتیب از نظر پارامترهاي خونی میتوان اعلام نمود که درصورتیکه میزان MCV و MCH درحد لب مرز - border line - ، و هموگلوبین A و A2 نرمال باشد ولی RBC بالا باشد ، دلالت بر ناقل آلفا تالاسمی دارد. و اگر RBC پایین همراه با هموگلوبین پائین گزارش شود، نشانه فقرآهن است. RBC بالا همراه با هموگلوبین پایین نشانه تالاسمی است. درصورتی که فرد ناقل آلفاتالاسمی باشد و همراه با آن فقرآهن شدید داشته باشد، کاهش نسبی RBC و کاهش هموگلوبین را شاهد خواهیم بود.
