بخشی از مقاله
چکیده
در این تحقیق امکان بهرهگیري از قارچهاي فوزاریوم - Fusarium spp. - ریزوسفر ریشه شلمی - Rapistrum rugosum - به عنوان عامل کنترل زیستی این علفهرز مطالعه شد. بذرهاي شلمی بر روي خاكهاي جمعآوري شده از مزارع گندم استانهاي آذربایجان شرقی، البرز، تهران، خراسان رضوي، خراسان شمالی، خوزستان، فارس، قزوین، مازندران، کرمانشاه و گلستان در شرایط گلخانه کشت شدند. قارچهاي فوزاریوم در ارتباط با ریشه این گیاه، جداسازي و خالصسازي شدند.
زیستسنجی در شرایط آزمایشگاهی و با بهرهگیري از یک محیط کشت آب-آگار قرار گرفته بر روي محیط برنج-آگار انجام شد. معیار معرفی یک عامل کنترل زیستی موفق براي علفهرز، بازدارندگی 70 درصد یا بیشتر بر رشد ریشهچه در نظر گرفته شد. جدایههاي انتخاب شده از مرحله قبل، براي ارزیابی میزبانگزینی اختصاصی، بر روي گیاهچه گندم رقم سیوند زیستسنجی شدند.
نتایج نشان داد که یک جدایه نه تنها بازدارندگی مناسبی 89/3 - درصد - بر روي علفهرز نشان داد بلکه براي گندم نیز ایمن 1/5 - درصد افزایش رشد - بود. نتایج شناسایی مورفولوژیک و مولکولی نشان داد که این جدایه نوعی F. oxysporum است. آگاهی از میکروارگانیسم-هاي مناسب براي کنترل زیستی علفهايهرز میتواند در تنوع بخشیدن به روشهاي کنترل موجود و حفظ ثبات کارایی علفکشهاي موجود یاري رسان باشد.
مقدمه
علفکشها مهمترین ابزار مدیریت علفهايهرز در مزارع گندم هستند - جیانسی و پوفر، 1991؛ زند و همکاران، - 2009، اما اثرات نامطلوب آنها بر سلامت انسان، محیط زیست و بروز پدیده مقاومت در علفهايهرز بر کسی پوشیده نیست. به ویژه بروز مقاومت نسبت به علفکشها در علفهاي هرز پدیدهاي است که کارایی علفکشهاي تجاري موجود در بازار را با تهدید جدي مواجه ساخته است. در نتیجه در چنین شرایطی تنوع بخشیدن به ابزار مدیریت علفهايهرز با هدف حفظ ثبات و کارایی علفکشهاي شیمیایی بالقوه موجود، بسیار ضروري خواهد بود.
براین اساس گرایش به سمت مدیریت غیرشیمیائی علفهايهرز رو به افزایش است - کرمر و کندي، . - 1996 کنترل زیستی علفهايهرز به عنوان رهیافتی مهم و امیدبخش در روشهاي مدیریت تلفیقی علفهايهرز مطرح است، اما این رهیافت براي مؤثر واقع شدن نیازمند در اختیار داشتن ابزار مناسب است. در این راستا میکروارگانیسمها ابزاري بالقوه و مناسب براي اجرائی کردن استراتژيهاي کنترل زیستی علفهايهرز هستند - استابز و کندي، . - 2012 در این بین قارچهاي جنس فوزاریوم - Fusarium spp. - از دیرباز به عنوان یکی از مهمترین عوامل کنترل زیستی مطرح بودهاند.
گونههاي زیادي از فوزاریوم وجود دارند که همزیست با ریشه گیاهان بوده و به نظر میرسد امکان بهرهگیري از آنها مانند یک علفکش خاك مصرف وجود داشته باشد. متاسفانه در کشور ما مطالعات چندان زیادي در رابطه با عوامل میکروبی بالقوه مناسب براي کنترل زیستی علفهايهرز انجام نشده است. در نتیجه این مطالعه با هدف امکان بهرهگیري از قارچهاي فوزاریوم در ارتباط با ریشه شلمی - Rapistrum rugosum L. - ، به عنوان یکی از علفهايهرز مهم مزارع گندم کشور که در رابطه با آن گزارش مقاومت نسبت به علفکشها وجود دارد، انجام شد.
مواد و روشها
جمع آوري مواد آزمایشی و کاشت گیاه: نمونههاي خاك از مزارع گندم استانهاي آذربایجان شرقی، البرز، تهران، خراسان رضوي، خراسان شمالی، خوزستان، فارس، قزوین، کرمانشاه، گلستان و مازندران جمع آوري شدند. بذرهاي شلمی ابتدا ضدعفونی سطحی شده و در شرایط آزمایشگاهی و بر روي پتريدیش جوانهدار شدند. بذرهاي جوانهدار شده بر روي نمونههاي خاك درون گلدان در شرایط گلخانه کشت شده و در مرحله پنج تا شش برگی، گیاهان با دقت از خاك خارج شده و ریشهها از محل طوقه جدا شدند.
جداسازي و خالصسازي قارچ از ریشه: ریشههاي گیاهان کشت شده ابتدا ضدعفونی سطحی شده و سپس با آب مقطر اتوکلاو شده شسته شدند. این ریشهها بهقطعات به طول حدوداً یک سانتیمتر برش زده شده و بر روي محیط کشت اختصاصی فوزاریوم، پنتاکلرو نیتروبنزن پپتون-آگار76، در دماي 25 درجه سانتیگراد کشت داده شدند. پس از 72 ساعت و شروع رشد قارچ از داخل ریشه، قسمتی از میسلیوم آن برداشته شده و به محیط کشت آب-آگار - WA - 77 دو درصد منتقل شد. براي خالصسازي جدایهها نوك هیف78 برداشته شده و به محیط سیبزمینی دکستروز-آگار79 منتقل شد. به این ترتیب جدایهها از ریشه گیاه جدا و خالصسازي شدند.
زیستسنجی جدایههاي فوزاریوم بر روي گیاهان و شناسایی آنها: براي ایجاد یک روش مؤثر زیستسنجی از محیط دولایه برنج-آگار - RAM - 80 و WA استفاده شد - کرمر، . - 2013 علت استفاده از محیط RAM امکان غربال بهتر جدایههایی با توانایی تولید توکسین مناسب گزارش شده است - کرمر، . - 2013 همچنین محیط WA رقیق شده این امکان را فراهم میکند که ریشههاي گیاهچه ضمن رشد مطلوب به داخل آن، در تماس با توکسینهاي رها شده از جدایهي قارچی در این محیط قرار بگیرند.
در این مرحله ابتدا محیط RAM درون ظرفهاي شیشهاي استوانهاي شکل کشت بافت به قطر هشت و ارتفاع شش سانتیمتر ریخته شده و سپس پلاگ 81هاي قارچی جدایههاي مورد نظر بر روي آن کشت شدند. پس از اینکه میسلیومهاي قارچ رشد کرده و تمام سطح محیط را پوشاندند - در حدود پنج تا هفت روز بسته به جدایههاي مختلف - ، محیط WA رقیق شده - 0/5 درصد - بر روي محیط آب-آگار و قارچ رشد کرده بر روي آن ریخته شد - به ضخامت حدود یک سانتیمتر - . بذرهاي ضد عفونی شده شلمی بر روي محیط WA دو درصد کشت داده شدند. به محض خروج ریشهچه - اندازه تقریبی -2 1 میلیمتر - ، بذرهاي جوانهدار شده بر روي محیط دولایه RAM-WA منتقل شدند.
تعداد 10 عدد گیاهچه براي هر تکرار در نظر گرفته شد. طرح آزمایش مورد استفاده به صورت کاملا تصادفی با چهار تکرار بود. براي تیمار شاهد تمام مراحل بیان شده انجام شد با این تفاوت که بر روي محیط RAM قارچ کشت نشده بود. شیشههاي کشت بافت در ژرمیناتور با دماي 25 درجه سانتیگراد در شرایط 8 ساعت نور و 16 ساعت تاریکی قرار داده شدند. بازدارندگی - درصد کاهش رشد ریشهچه در مقایسه با شاهد - بر روي رشد ریشهچه گیاهچه شلمی پس از هفت روز ارزیابی شد. جدایههاي قارچی که مقدار مشخصی از درصد بازدارندگی - ≥70 - را بر روي گیاهچه شلمی نشان داده بودند براي آزمون میزبان گزینی اختصاصی٨٢ انتخاب شدند.
براي انجام آزمون میزبان گزینی اختصاصی جدایههاي قارچی انتخاب شده از مرحله قبل، زیستسنجی از آنها بر روي گیاهچه گندم رقم سیوند طبق روش قیل انجام شد. براي این منظور تعداد ده عدد گیاهچه گندم بر روي هر ظرف شیشهاي کشت بافت در پنج تکرار در قالب طرح کاملاً تصادفی کشت شد. در نهایت جدایههایی براي گندم ایمن در نظر گرفته شدند که میزان بازدارندگی کمی - کمتر از 10 درصد - بر روي گیاهچههاي گندم نشان داده بودند. این جدایهها با روشهاي مورفولوژیک و مولکولی شناسایی شدند.
نتایج و بحث
تعداد 97 جدایه مختلف از شلمی کشت داده شده بر روي خاك مزارع گندم استانهاي مختلف جداسازي و شناسایی شد. در غربالگري ابتدایی صورت گرفته بر روي گیاهچه شلمی، تعداد 12 جدایه بازدارندگی مؤثر در کاهش رشد ریشهچه شلمی نشان دادند. در نتیجه این جدایهها براي انجام آزمون میزبان گزینی اختصاصی، بر روي گیاهچه گندم زیستسنجی شدند.
یک جدایه که بر روي شلمی بازدارندگی قابل قبولی نشان داده و براي گندم نیز ایمن بود، به عنوان یک عامل کنترل زیستی مطلوب تشخیص داده شد. پس از شناسایی صورت گرفته مشخص شد که این جدایه نوعی F. Oxysporum است - شکل - 1 که از خاك البرز جداسازي شده بود، بر روي شلمی 89/3 درصد بازدارندگی نشان داده بود ضمن این که 1/5درصد رشد ریشهچه گندم را نیز افزایش داد - شکل . - 2
F. oxysporum از گذشته به عنوان یکی از مهمترین گونههاي فوزاریوم براي کنترل انتخابی علفهايهرز مطرح بوده است. در گذشته F. oxysporum به عنوان اندوفیت گونههاي گیاهی زراعی و وحشی گزارش شده - لسلاي و همکاران، 1990؛ باکن و هینتون، - 1996 و براي مثال در کنترل انتخابی گل جالیز - Orobanche spp. - و استرایگا - Striga hermonthica - استفاده شده است - سیتولا و همکاران، . - 1995 در این راستا این مطالعه نویدبخش امکان بهرهگیري از میکروارگانیسمها به عنوان ابزار کنترل زیستی علفهايهرز، در راستاي تنوع بخشیدن و تکامل روشهاي مدیریت آنها است.
