بخشی از مقاله
چکیده
با مشخص شدن کروموزوم، علم سیتوژنتیک پایهگذاری گردید. خصوصیات گیاهی تا حدود زیادی تحت کنترل مواد ژنتیکی هسته میباشد. در پژوهشهای بهنژادی، تلاقی بین گونههایی که از شباهت کروموزومی بیشتری برخوردار هستند، موفقیتآمیزتر است. لذا گونههایی که از لحاظ پارامترهای سیتوژنتیکی و خصوصیات کاریوتیپی به همدیگر شبیه هستند در روابط بینگونهای، قرابت بیشتری داشته و در صورت وجود صفات مطلوب، امکان تلاقیهای بین گونهای در یک گیاه وجود خواهد داشت.
در میان بافتهای گیاهی معمولا مریستمهای نوک ریشه برای تهیه کروموزوم استفاده میشود. روش دورگهسازی فلئورسنت در محل - FISH - آغازی برای سیتوژنتیک مولکولی بود. این تکنیک یک روش خوب برای تشخیص تغییرات کروموزومی در میان گونههای مرتبط نزدیک با کاریوتیپهای محافظت شده، میباشد و در سلولهای متافازی، برای آزمایشهای ویژه و فراتر از نتایج سیتوژنتیکی معمول یا برای شناسایی حذف یا اضافه شدن کروموزومی استفاده میشود.
مقدمه
سیتوژنتیک، علمی دورگ، و ترکیبی از سیتولوژی - مطالعه کروموزوم و اجزای آن - و ژنتیک - مطالعه توارث - میباشد. این علم به نحوه فعالیت، رفتار و سازوکار انتقال کروموزومها طی تقسیمهای سلولی میتوز و میوز، تعداد و ساختار کروموزومها، ناهنجاریهای کروموزومی از نظر تعداد و ساختمان آنها در طی نوترکیبی و انتقال و تظاهر ژنها میپردازد.
بهطور کلی شاید بتوان سیتوژنتیک را علم کروموزوم نامید، که مشتمل بر مشخصات میکروسکوپی - الکترونی و نوری - و مولکولی کروموزومها است . - Omidi et al ., 2013 - بررسی تغییرات کروموزومی بااستفاده از کاریوتیپ اغلب از طریق ایجاد محدودیت در توانایی شناسایی کروموزومهای فردی ناشی از کمبود نشانگرها مانع کار میشود.
از اینرو، تکنیک های باندینگ کروموزوم مانند گیمسا باندینگ، باندینگ فلوروکروم و FISH به کار گرفته میشود . - Kirow et al., 2016 - روش دورگهسازی فلئورسنت در محل - Fluorescent in Situ Hybridization=FISH - در سال 1980 معرفی شد که آغازی برای سیتوژنتیک مولکولی بود FISH . - Madon et al., 2010 - در پزشکی و زیستشناسی رشدونمو برای محلی سازی توالیهای خاص DNA در کروموزومهای پستاندار آغاز شده است .
- Trask, 1991 - یکی از اولین تلاشها برای استفاده از FISH در بررسی درختان جنگلی روی 11 گونه از جنس - Zoldos et al., 1999 - Quercus، و گونههای متعددی از قبیل slash pine - Doudrick et al., 1995 - ، و دو European spruces - Silijak-Yakovlev, 2002 - ، انجام شده است. هدف این تکنیک پیدا کردن توالیهای RNA یا DNA در کروموزومهای متافازی، سلولهای اینترفازی و قطعات بافتی است و از پروبهای فلوئورسنتی استفاده میکند که تنها به بخشهایی از کروموزوم متصل میشوند . - Chen et al., 1995 -
مواد و روشها
در میان بافتهای گیاهی حاوی سلولهای در حال تقسیم، مریستمهای نوک ریشه یکی از معمولترینها هستند که برای تهیه کروموزومهای میتوزی استفاده میشود. بهمنظور استفاده از مریستمهای نوک ریشه بذرهای گونه مورد نظر کاشته میشوند و تا زمان جوانهزنی و رشد ریشهها آبیاری شده و نمونهگیری در ساعات اولیه صبح انجام میشود.
مراحل انجام تکنیک FISH بهطورخلاصه شامل پیشتیمار سلولهای تثبیتشده روی لام با محلولهای نمکی و چند دترجنت برای حذف پسزمینه اضافی و نفوذپذیر ساختن سلولها سپس واسرشت کردن دو رشته DNA هم پروپ و هم کروموزوم بهطوری که آنها بتوانند به همدیگر متصل شوند. در مرحله بعد پروب بر روی اسلاید قرار داده میشود و یک لامل شیشهای بر روی آن گذاشته میشود.
برای جلوگیری از تبخیر آن لبههای لامل با چسب مهروموم میشود. سپس اسلاید در انکوباتور 37 - درجه سانتیگراد - به مدت یک شب قرار داده میشود تا پروپها با جایگاههای مکمل خود روی کروموزوم هدف هیبرید شوند. در طول شب، DNA پروب توالی هدف خود را در کروموزوم خاص جستجو میکند و به آن متصل میشود. روز بعد لامل برداشته میشود و اسلاید در محلول دترجنت یا نمک شسته میشود تا هر پروبی که به کروموزوم متصل نشده است برداشته شود.
در آخر یک رنگ فلوئورسنت متمایز - Counter stain - به اسلاید اضافی میشود تا کل کروموزومها رنگ بگیرند. بهطوری که آنها با استفاده از میکروسکوپ فلوئورسنت قابل مشاهده و آنالیز شوند. رنگهایی که بهطور معمول برای رنگآمیزی کروموزومهای متافازی یا هستههای اینترفازی استفاده میشوند عبارتند از پروپیدیوم یدید PropidiumIodid - PI - و دیآمیدینو فنیلایندو Diamidino-2-phenylindole - DAPI - که بسته به رنگ کاوشگرهای بکار گرفته شده رنگی که تمایز بیشتری ایجاد کند مورد استفاده قرار میگیرد . - Chen et al., 1995 -
نتایج
Islam-faridi و همکاران - 2009 - به تجزیهوتحلیل شاهبلوط آمریکایی - Castanea dentata - با استفاده از دورگهسازی فلئورسنت در محل پرداختند. گروهی از دانشمندان از سال 1980 به منظور توسعه مقاومت شاهبلوط آمریکایی در برابر آفات از طریق زادآوری درونگونهای backcross با شاهبلوط نسبتا مقاوم چینی - castanea mollissima - کار میکنند.
در تلاش برای تسهیل این برنامه زادآوری Islam-faridi و همکاران - 2009 - مطالعات سیتوژتیک این دو گونه و F1 و هیبریدهای backcross آنها را شروع کردند. موفقیتشان در ساختن کروموزومهای سوماتیک با استفاده از هضم آنزیمی جوانه نوک ریشه نهال شاهبلوط آمریکایی و چگونگی گسترش کروموزوم با استفاده از دورگهسازی فلئورسنت در محل با پروبهای DNA ریبوزومی را گزارش کردند. نتایج دو مکان 18S-28S rDNA، یک مکان بزرگ و یک مکان کوچک، و یک مکان 5S rDNA را در شاه بلوط آمریکایی نشان میدهد.
این اولین گزارش چنینی برای شاه بلوط آمریکایی است و نتایج اولیه شبیه شاهبلوط چینی پدیدار شد. در مطالعهای دیگر Goryachkina و همکاران - 2012 - به تجزیهوتحلیل سیتوژنتیک مولکولی گونههای لاریکس سیبری بهوسیله ی دورگهسازی فلئورسنت در محل پرداختند. دادههای مربوط به مطالعه سیتوژنتیک سه گونه لاریکس L. sibirica - ، L. gmelinii و - L. cajanderi که به طور گستردهای در جنگلهای سیبری پراکنش یافتهاند موجود بود.
دورگهسازی فلئورسنت در محل - FISH - با پروبهای ژن 45S و RNA 5S ریبوزومی و رنگآمیزی DAPI اجازه شناسایی جفتهای کروموزوم همولوگ در کاریوتیپهای کاج اروپایی - larch - و تسهیل آنالیزهای کاریوتیپ مقایسهای را میدهد. دو گونه نزدیک وابسته، L. gmelinii و L. cajanderi، الگوهای مشابه هیبریداسیون را نشان دادند. تفاوت در مکانهای سیگنال FISH مقایسه شد و تنوع کاریوتیپ درونی و بین فردی در جنس لاریکس مورد بحث قرار گرفت.
Ribeiro و همکاران - 2012 - به مطالعه الگوهای rDNA fish در fagaceae پرداختند. در این کار تشکیل و تکامل ژنوم در داخل خانواده، بهوسیله نقشهبرداری کاریوتیپی و فیزیکی rDNA در ده گونه اروپایی و آسیایی جنس Fagus، Quercus، و Castanea مورد مطالعه قرار گرفت. تمام گونههای مورد مطالعه تعداد کروموزومی 2n = 2x = 24 داشتند، به جز اولین گزارش یک فرد واحد از Quercus suber که ثابت شد تریپلوئیدی - 2n=3x=36 - است.
بحث و نتیجهگیری
تحقیقات سیتوتاکسونومی، علاوه بر مشخص کردن ارتباط و قرابت بین جمعیتها و تنوع بین آنها، میتواند اطلاعات باارزشی در مورد خزانه ژنی موجود در کشور بهمنظور بهرهگیری در بانک ژن فراهم آورد. بنابراین انجام مطالعات سیتوژنتیکی در گونههای گیاهی و همچنین جمعیتهای متعلق به آنها، خصوصا گیاهان وحشی و بومی، بهدلیل فراهم نمودن اطلاعات کمی روی تاریخچه تکاملی گیاه، تعیین قرابتهای بینگونهای، تعیین مشخصات کاریولوژیکی و غیره، از اهمیت فوقالعادهای برخوردار است .
- Hesamzadeh et al., 2007 - دورگهسازی فلئورسنت در محل - FISH - یک تکنولوژی ژنتیک سلولی-مولکولی نسبتا جدیدی است که با استفاده از مواد فلورسنت، پروبهای DNA، برچسبگذاری شده و با کشف یا تایید ژن یا بینظمیهای کروموزومی که عموما قابل تحلیلتر از روشهای سیتولوژی معمول است، میتواند استفاده شود. این تکنیک در سلولهای متافازی و اینترفازی بهراحتی قابل استفاده است و در سلولهای متافازی، برای آزمایشهای ویژه و فراتر از نتایج سیتوژنتیکی معمول یا برای شناسایی حذف یا اضافه شدن کروموزومی استفاده میشود . - Arzani, 1996 -
در نهایت میتوان گفت که با استفاده از روش FISH، بسیاری از ناهنجاریهای کروموزومی که تا پیش از آن توسط دیگر روشهای سیتولوژی قابل تشخیص نبود، شناسایی میشوند . - Noori Daloii and Alizadeh, 2011 - همچنین FISH تکنیکی نوین، سریع، دقیق و کارآمد را در بررسیهای ژنوم، کاریوتیپ، پلوئیدی و شجره و اعقابشناسی یا همان فیلوژنتیک گونههای گیاهی فراهم میکند . - Ribeiro et al., 2012 -
در رابطه با استفاده از این تکنیک در مورد گونههای جنگلی در ایران مطالعهای انجام نشده است و حتی در سراسر دنیا هم تعداد بسیار محدودی از مطالعاتی که با این روش انجام شدهاند در رابطه با گونههای جنگلی هستند. لذا تکنیک FISH به عنوان ابزاری ایدهآل جهت استفاده در مطالعات سیتوتاکسونومی درختان جنگلی میتواند مطرح باشد.
