بخشی از مقاله
چکیده
کلستریدیومها باکتریهای بی هوازی، اسپور زا، گرم مثبت و اکثراً متحرک - بجز کلستریدیوم پرفرینجنس - هستند. این باکتریها در خاک، آب، دستگاه گوارش انسان و حیوانات یافت می شوند و به واسطه تولید توکسین های متعدد باعث بیماریهای بالینی و تحت بالینی زیادی می گردند. هدف این مطالعه ارزیابی اهمیت محیط های کشت اختصاصی در جداسازی و تشخیص سریع باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس از طیور گوشتی می باشد.
تعداد 150 نمونه از محتویات قسمت های مختلف روده طیور گوشتی در زمان کشتار جمع آوری گردید. کشت بر اساس دستورالعملهای استاندارد بر روی محیط های بلاد آگار، بلاد آگار حاوی نئومایسین، SPS آگار و TSC آگار انجام شد و رشد کلنی ها پس از 48 ساعت انکوباسیون در شرایط بی هوازی در دمای 37 درجه سانتیگراد از لحاظ مورفولوژی و نوع همولیز بررسی گردید.
تستهای تکمیلی بیوشیمیایی جهت تایید گونههای کلستریدیوم پرفرینجنس انجام گردید. بیشترین راندمان جداسازی در کشت بر روی محیط بلاد نئومایسین دار و کمترین آن از کشت بر روی محیط بلاد آگار معمولی حاصل گردید . - P<0.05 - محیط کشت TSC آگار و سپس SPS آگار با ایجاد کلنیهای سر سیاه از باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس بیشترین اختصاصیت را در جداسازی این باکتری نشان دادند . - P<0.001 - استفاده از محیط های اختصاصی برای جداسازی باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس می تواند با کاهش هزینهها و زمان جداسازی به فرایند تشخیص این پاتوژن کمک شایانی نماید.
مقدمه
کلستریدیوم ها باکتریهای بی هوازی، اسپور زا، گرم مثبت و اکثراً متحرک هستند - بجز کلستریدیوم پرفرینجنس - که در خاک، آب، دستگاه گوارش انسان و حیوانات یافت می شوند. کلستریدیوم ها به واسطه تولید توکسین های متعدد باعث بیماری های بالینی و تحت بالینی در انسان و حیوانات می شوند
کلستریدیوم پرفرینجنس به فراوانی در محیط و دستگاه گوارش پستانداران و پرندگان متعددی یافت می شود و بعنوان یک فلور باکتریایی شناخته می شو
این باکتری به عنوان یک پاتوژن مهم در حیوانات اهلی، حیات وحش، طیور و انسان مطرح میباشد و میتواند باعث قانقاریای گاز دار و مسمومیت غذایی در انسان، آنتریت نکروتیک طیور، انتروتوکسمی در برهها و گوسالهها و انتریت در خوک، گاو، سگ و اسب ها شود
محیط کشت SPS آگار برای جداسازی اختصاصی و شمارش کلستریدیوم پرفرینجنس از مواد غذایی استفاده می شود. این محیط شامل طیف وسیعی از مواد مغذی است. سولفیت که توسط اکثر کلستریدیوم ها به سولفید
احیا می شود با سیترات آهن موجود در محیط واکنش نشان میدهد و تولید کلنی های سیاه میکند. دیگر میکروارگانیسمهای که می توانند سولفیت را احیا کنند توسط پلی میکسین و سولفادیازین - سولفاپریمیدین - موجود در محیط رشدشان متوقف میشود. میکروارگانیسم های کمی مثل کلستریدیوم اسپوروژنز می توانند شبیه کلستریدیوم پرفرینجنس در این محیط رشد کنند که با رنگ آمیزی گرم و اسپور می توان آنها را تفکیک کرد
محیط کشت TSC آگار نیز با همین فرایند شیمیایی ایجاد کلنیهای سرسیاه در کشت باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس مینماید. در صورت نقص در فرایندهای کشتار دام یا طیور و عدم رعایت بهداشت حین کشتار و فراوری مواد پروتئینی امکان آلودگی این مواد با منشاء دامی به باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس وجود دارد. لذا یکی از ارکان مهم در کنترل کیفیت مواد غذایی شناسایی سریع این باکتری در نمونههای مواد غذایی میباشد. هدف این مطالعه ارزیابی اهمیت محیطهای کشت اختصاصی در جداسازی و تشخیص کلستریدیوم پرفرینجنسهای پاتوژن از طیور گوشتی می باشد.
مواد و روشها
در این مطالعه از محتویات روده طیور گوشتی شهرهای مختلف استان کرمان در زمان کشتار نمونه گیری انجام گردید. از 15 مرغداری تعداد 150 نمونه از محتویات قسمت های مختلف روده جمع آوری گردید و بلافاصله توسط محیط انتقالی به آزمایشگاه میکروبیولوژی موسسه رازی کرمان منتقل گردید. به منظور جداسازی باکتریهای جنس کلستریدیوم، طبق دستورالعمل استاندارد، کشت بر روی محیط های بلاد آگار، بلاد آگار حاوی نئومایسین، SPS آگار1 و TSC آگار2 انجام شد و رشد کلنی ها پس از 48 ساعت انکوباسیون در شرایط بی هوازی در دمای 37 درجه سانتیگراد از لحاظ مورفولوژی و نوع همولیز بررسی گردید. با استفاده از رنگ آمیزی گرم و تستهای تکمیلی بیوشیمیایی - بر اساس پروتکل های %HUJH\ʼV - manual از جمله کاتالاز، تخمیر کربوهیدراتها - گلوکز، ساکارز، لاکتوز و مالتوز - ، هیدرولیز ژلاتین، تولید اندول، واکنش شیر تورنسل دار، تجزیه ی لسیتین، لیپاز و آزمون حرکت، گونه های کلستریدیوم شناسایی شدند و تایید گونه های کلستریدیوم پرفرینجنس انجام گردید. شمارش کلنی های باکتریهای رشد کرده بر روی هر یک از محیط ها انجام شد و نتایج با آنالیز های توصیفی آماری در نرم افزار SPSS آنالیز شدند.
نتایج و بحث
گونه های کلستریدیوم از همه محیط های کشت تحت بررسی جدا گردید اما میزان جداسازی باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس و اختصاصیت جداسازی در محیطهای مختلف متفاوت بود. میانگین تعداد باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس بدست آمده از محیط های کشت مختلف در جدول 1 نمایش داده شده است. بیشترین راندمان جداسازی در کشت بر روی محیط بلاد نئومایسین دار و کمترین آن از کشت بر روی محیط بلاد آگار معمولی حاصل گردید . - P<0.05 - محیط کشت TSC آگار و سپس SPS آگار با ایجاد کلنی های سر سیاه از باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس بیشترین اختصاصیت را در جداسازی این باکتری نشان دادند
جدول -1 میانگین تعداد باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس بدست آمده از محیط های مختلف
شکل -1 کلنی های سیاه رنگ باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس بر روی محیط TSC آگار
استفاده از محیط های کشت افتراقی و اختصاصی استفاده زیادی در شناسایی سریع و تشخیص گونه های باکتریایی دارد. در شناسایی باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس نیز از محیط های متفاوتی برای این منظور استفاده گردیده است و نتایج متفاوتی بدست آمده است
محیط TSC آگار برای جداسازی و شمارش شکل های رویا و اسپور کلستریدیوم پرفرینجنس در غذا، نمونههای بالینی و سایر مواد کاربرد دارد
از این محیط برای جداسازی و شمارش کلستریدیاهای مدفوعی در فیلتراسیون غشایی و کلستریدیوم پرفرینجنس در آب نیز استفاده می شود
نکته مهم در استفاده از محیط های اختصاصی انتخاب مناسبترین محیط کشت می باشد که هم ارزان بوده و مقرون به صرفه باشد و هم در دسترس باشد. با توجه به گران بودن اکثر محیط های کشت اختصاصی که نیازمند استفاده از مکمل های متفاوت - از جمله آنتی بیوتیک ها - برای افزودن به محیط می باشند، استفاده از محیط های در دسترس با افزودن بعضی از آنتی بیو تیک ها به محیط نتایج مناسبی را بهمراه داشته باشد.
در مطالعه حاضر نیز در خصوص جداسازی و تشخیص باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس نتایج کشت نمونه بر روی محیط بلاد آگار حاوی نئومایسین نتایج خوبی را به همراه داشت و بیشترین راندمان جداسازی در کشت بر روی این محیط حاصل گردید اما اختصاصیت کمتری نسبت به محیط های TSC و SPS آگار داشت. لذا استفاده از این محیط برای جداسازی این باکتری توصیه می گردد. البته استفاده از محیط های اختصاصی یا افتراقی نیز می تواند با کاهش هزینهها و زمان جداسازی به فرایند جداسازی و تشخیص باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس در موارد خاص کمک شایانی نماید و بعنوان یک تایید کننده سویه های جدا شده در مراحل انتهایی جداسازی از مواد غذایی یا نمونه های بیولوژیک کاربرد داشته باشد.
