بخشی از مقاله
چکیده
استفاده از تکنیک SDS-PAGE به عنوان یک روش ارزان و ساده جهت مطالعه تنوعژنتیکی واریتههای گیاهی کاربرد دارد. استفاده از تکنیک SDS-PAGE یک روش ارزان، ساده و مناسب جهت بررسی تنوعژنتیکی ارقام و ژنوتیپهای گیاهی می باشد. زیره سبز - Cumin - با نام علمی Cuminum cyminum L. گیاهی یکساله و علفی متعلق به خانواده جعفری یا چتریان - Apiaceae - است. تفکیک پروتئینهای ذخیرهای بذر بر اساس روش الملی و باکمک سیستم الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید در حضور سدیم دو دسیل سولفات در ژل جدا کننده 12/9 درصد و ژل متراکم کننده پنج درصد صورت پذیرفت.
مقایسه الگوی باندی حاصل از الکتروفورز پروتئینهای محلول در بذر ژنوتیپهای بدست آمده نشان داد که باندهای پروتئینی نه تنها از نظر محل قرار گرفتن روی ژل و وزن ملکولی، بلکه از لحاظ تراکم و شدت نیز با یکدیگر اختالف داشتند. در این مطالعه بیشترین تغییرات در ناحیه سایز مارکر 12 تا 49 دیده شد. ژنوتیپ هنک و جیرفت به ترتیب بیشترین و کمترین تعداد باند را داشتند و بیشترین فاصله ژنتیکی بین ژنوتیپهای ماهان و جیرفت بود.
ماتریس تشابه محاسبه و تجزیه خوشهای بر اساس ضریب تشابه جاکارد به روش UPGMA انجام گردید. در رنگآمیزی با کوماسی بلو دامنه ضرایب تشابه از 3/93 تا 3/23 متغیر بود. بنابراین از باندهای اختصاصی واریتههایی که مورد شناسایی واقع شدند برای تشخیص هیبریدها در برنامههای اصالحی برای استفاده بهنژادگران بکار میروند. بنابراین پیشنهاد میشود که از SDS-PAGE پروتئین بذر برای شناسایی ژنوتیپهای زیره سبز در برنامههای اصالحی استفاده گردد.
مقدمه
زیره سبز بومی مناطق مرکزی و جنوبی آسیا بوده و در چند کشور از جمله هند، پاکستان، ترکیه، ایران، مصر و اسپانیا کشت میشود، این گیاه قدیمیترین و از نظر اقتصادی مهم ترین گونه در این خانواده می باشد که مصارف دارویی، غذایی و صنعتی فراوانی دارد - کافی و همکاران، . - 1321 به منظور مطالعه ژنوتیپ های مورد مطالعه زیره سبز به لحاظ تنوع بیان پروتئینی بذر، از تکنیک SDS-PAGE برای این منظور استفاده گردید.
الکتروفورز ژل پلیاکریل آمید جهت تعیین وزن ملکولی پروتئینها، روشی رایج و مهم در آزمایشگاههای تحقیقاتی میباشد، این روش ضمن ساده بودن به مقدار کمی نمونه برای انجام آزمایش نیاز دارد و دارای قدرت تفکیک مناسب برای شناسایی و تعیین خلوص پروتئینهاست
گسترده ترین تکنیک جهت توصیف بیوشیمیایی جمعیتهای گیاهی، روشهای الکتروفورز پروتئین است. پروتئینهای ذخیرهای ضمن داشتن چندشکلی زیاد بسیار باثبات هستند بنابراین الگوهای الکتروفورزی پروتئین ذخیره بذر به تنهایی یا با سایر نشانگرها معیار بسیار خوبی برای شناسایی جمعیتهای گیاهی و ارقام خواهد بود
به جهت ثابت بودن نوع و میزان پروتئینهای ذخیرهای بذر بالغ نسبت به سایر بافتهای گیاهی، تحلیل آنها میتواند ابزاری ارزشمند جهت شناسایی جمعیتها و گونههای گیاهی باشد. پژوهشگران بهنژادی همیشه در پی یافتن نشانگرهای ژنتیکی و بیوشیمیایی هستند تا بتوان از این نشانگرها به عنوان معیارهای غیرمستقیم گزینش استفاده کنند - بهی و همکاران، . - 1352 هدف از این گزارش، مطالعه تغییرات الگوی پروتئینهای بذر ژنوتیپهای زیره سبز و مشاهده تنوع بین ژتوتیپها با استفاده از روش SDS-PAGE بذر میباشد.
مواد و روشها
این پژوهش در دانشگاه پیام نور مرکز اسدآباد صورت گرفت. تعداد 4 ژنوتیپ زیره سبز به نام های ماهان، جوپار، هنک و جیرفت مورد برررسی قرار گرفتند.
استخراج پروتئین بذر
ابتدا 293 میلیگرمی از بذر ژنوتیپها در داخل هاون چینی کوبیده و پودر شدند. پروتئین پودر شده درون میکروتیوبهای دو میلیلیتری قرار داده شدند و از بافر استخراج پروتئین - روش یانگ و همکاران، 2336 با اندکی تغییرات - پر شد. و به مدت 23 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با دور 13933 rpm سانتریفیوژ گردید. سپس محلول رویی در دو میکروتیوب توزیع گردید و با محلول TCA-Aceton میکروتیوب پر شد و به مدت یک ساعت در فریزر باقی ماند و سپس در دمای 4 درجه سانتیگراد با دور 13933 rpm به مدت 23 دقیقه سانتریفیوژ گردید پس از ته نشین شدن پروتئین، محلول رویی دور ریخته شد و با استون سه بار شستشو گردید و نهایتاً با بافر لیز کننده به میزان 193میکرولیتر مخلوط گردید، به مدت یک ساعت شیک گردید و با روش برادفورد 1575، در 959 نانومتر جذب نمونهها قرائت گردید.
الکتروفورز پروتئین بذر استخراجی
در این مطالعه برای الکتروفورز پروتئین از روش SDS-PAGE استفاده گردید. SDS-PAGE در ژل جدا کننده 12/9 درصد و ژل متراکم کننده 9 درصد، به روش الملی با برخی تغییرات انجام پذیرفت. ابتدا مقدار پروتئین نمونهها به روش فوق تعیین و سپس مقدار 19 میکرولیتر از هر نمونه با غلظت یکسان روی ژل بارگذاری گردید. الکتروفورز با شدت جریان 29 آمپر و ولتاژ 193 ولت تا رسیدن نشانه رنگی به پایین ژل ادامه یافت. از پروتئینهای اوترانسفرین 72 - کیلودالتون - ، آلبومین گاوی 66 - کیلودالتون - ، اوآلبومین 49 - کیلودالتون - ، اکتینیدین 25 - کیلودالتون - ، بتا-الکتوگلوبولین 12 - کیلودالتون - و لیزوزیم 14 - کیلودالتون - به عنوان نشانگر در ژل استفاده گردید. الکتروفورز با ولتاژ 93 ولت در ژل متراکم کننده به مدت 3/9 ساعت و ولتاژ 193 ولت در ژل جدا کننده به مدت 1/9 ساعت با دستگاه پاورساپالی انجام گردید.
رنگآمیزی و رنگبری ژل پلی اکریل آمید
به منظور مشاهده باندهای پروتئینی، رنگآمیزی با کمک کوماسی بلو به مدت 9 ساعت روی شیکر انجام گرفت. جهت آشکار شدن باندهای پروتئینی از محلول رنگبر - متانول، اسیداستیک گالسیال و آب مقطر - در چند مرحله تا روشن شدن زمینه ژل صورت پذیرفت و سپس ژل اسکن شد.
تحلیل آماری دادهها
بر اساس مطالعات چشمی، باندها بر اساس حضور - کد - 1 و عدم حضور - کد - 3 در هر نمونه امتیازدهی شدند. جهت تعیین فاصله ژنتیکی، ماتریس دو طرفه ارقام و متغیرها بر اساس کد 1 و 3 تشکیل شد و بنابراین آنالیز دادهها با کمک نرم افزار NTsys صورت گرفت. تجزیه خوشهای بر مبنای ضریب تشابه جاکارد صورت گرفت و دتدروگرام با استفاده از روش UPGMA ترسیم گردید.
نتیجه و بحث
شکل 1 الگوی الکتروفورزی پروتئینهای محلول بذر را در ژنوتیپهای مختلف زیره سبز را نشان میدهد. نظر به این فرض که پروتئینها فرآوردههای نسبتاً مستقیم ژن میباشند و هر یک از نوارها به عنوان یک صفت هستند و تفاوت در الگوی پروتئینی، نمایانگر اختالف وراثتی معنیدار در بین ژنوتیپهای مورد مطالعه میباشد. باندها در نمونههای مورد آزمایش تفاوتهایی از خود نشان دادند. تراکم و میزان باندهای حاصل در ژنوتیپها بسیار شبیه به همدیگر میباشد اما برخی از باندهای پروتئینی نه تنها از نظر محل قرار گرفتن روی ژل و وزن ملکولی، بلکه از لحاظ تراکم و شدت نیز با یکدیگر اختالف نشان دادند.
بیشترین تفاوتها در الگوی بیان پروتئینهای بذر زیره در محدوده 22، 25 و 29 کیلودالتون میباشد که در محدوده 22 کیلو دالتون همانطوری که از تصویر ژل پیداست در محدود 25 کیلو دالتونی ژنوتیپهای هنک و جوپار دارای باند حذف شده میباشند که ژنوتیپ ماهان دارای بیان باند پروتئینی در این محدوده میباشد و همچنین در محدوده 29 کیلودالتونی نیز ژنوتیپهای هنک و جوپار دارای باند حذف شده میباشند که در مقابل ژنوتیپ ماهان دارای باند هست، و این حضور و عدم حضور متنوع در این ژنوتیپها مؤید وجوع تنوع به لحاظ بیان در الگوی پروتئینی میباشد.
از نظر شدت و ضعف حضور باند پروتئینی در ژنوتیپهای مورد مطالعه عالوه بر حضور و عدم حضور باند تنوع قابل بیانی را قابل مشاهده کرده است، در محدوده 61، 49 ، 32 و 29 کیلودالتونی ژنوتیپ ماهان دارای باند قویتر - ماژور - را نسبت به ژنوتیپهای هنک و جوپار ایجاد کرده است، در محدوده 12کیلودالتونی ژنوتیپ جوپار دارای باند پروتئینی ضعیفتری نسبت به سایر ژنوتیپ در این محدوده میباشند. در بین الگوی پروتئین بذرها در مجموع حدود 23 باند پروتئینی شناسایی گردید.
حسینی زاده و همکاران، 1325 در مطالعهی با عنوان مقایسه دورگهای بین گونهای لولیوم با والدین آنها با استفاده از الکتروفورز پروتئینهای ذخیرهای بذر، نتایج خود را اینگونه ابراز داشتند که در مجموع 23 باند در پروفیل تمامی ژنوتیپهای مورد مطالعه مشاهده شد و از نظر تعداد معدودی از باندها تفاوتهای آشکاری بین ژنوتیپهای والدینی و نتاج مشاهده گردید. تفاوتهایی نیز در ضخامت و شدت نوارهای الکتروفورزی ژنوتیپهای مورد مطالعه مشاهده شد که میتواند ناشی از تفاوت در شدت بیان ژنهای مربوطه در والدین و نتاج باشد.
به طور کلی مقایسه پروفیل باندهای پروتئینی ضمن نشان دادن تفاوتهای آشکار بین دو گونه والدینی از نظر باندهای پروتئینی، دورگ بودن نتاج حاصل از تالقی بین گونهای نیز تأیید گردید. شکل 2 نمودار تجزیه خوشهای ژنوتیپهای زیره مورد مطالعه را نمایش میدهد همانطوری که مشخص است ژنوتیپ شماره 1 و 4 دارای بیشترین فاصله ژنتیکی میباشند و در فاصله 3/67 ژنوتیپها را به دو گروه تقسم میکند که ژنوتیپ شماره 1 در گروه اول و ژنوتیپهای شماره 2، 3 و 4 در گروه دوم قرار گرفتهاند. جدول 1 ماتریس تشابه جاکارد بر اساس نشانگر پروتئینی ژنوتیپهای زیره سبز مورد مطالعه را نشان میدهد براساس این جدول بیشترین تشابه ژنتیکی بین دو ژنوتیپ هنک و جیرفت - 3/23 - و کمترین فاصله ژنتیکی بین دو ژنوتیپ ماهان و جوپار - 3/9 - بود.
