بخشی از مقاله
چکیده:
تولید زیست داروها و پروتئین هاي مهم کاربردي از طریق گیاهان را اصطلاحا کشاورزي مولکولی گویند. از زمانی که اولین پروتئین نوترکیب دارویی که در سال 1986 در توتون تولید گردید، رنج گستردهاي از پروتئینهاي مورد نیاز بخش پزشکی در گیاهان تولید شده است. پروتئین هاي حاصل از گیاهان عاري از اندوتوکسین هاي مضر، عوامل بیماریزاي جانوري ، پاتوژن هاي بالقوه انسانی و DNA ي انکوژن و ویروسی هستند که در سیستم هاي بیانی رایج مانند کشت سلول هاي جانوري و پروکاریوتی احتمال حضورشان وجود دارد و از این جهت مدلی ایدال براي بیان پروتئین هاي درمانی و تشخیصی می باشند.
با توجه به پایداري گیاه تراریخت گیاهان اقتصادي ترین سیستم براي تولید مقادیر فراوان پروتئین هاي نوترکیب می باشند. بنا به دلایل فوق این پروژه مهم در دانشگاه تربیت مدرس طراحی گردید، در این پروژه ما از گیاهان به منظور تولید پروتئینهاي نوترکیب استفاده نمودیم. در این تحقیقات ما تعدادي از پروتئینهاي نوترکیب مانند: آنتیبادي تک دمنی VHH علیه آنتی ژن Muc، پروتئین tPA و اینترفرون گاما را در گیاهان توتون و کلزا تولید نمودیم.
ابتداً ژنهاي پروتئینهاي نوترکیب بوسیله اگروباکتریوم به ژنوم گیاهان مرد نظر منتقل گردید. گیاهان تراریخت باززایی شده بر سطح محیط کشت حاوي کانامایسین انتخاب و به خاك منتقل شدند تا نسل بعد از آنها بدست آید. حضور ژنهاي نوترکیب در گیاهان تراریخت با بهره گیر از آغازگرهاي اختصاصی و تکنیک PCR تأیید گردید. فعالیت پروتئین هاي نوترکیب VHH - تا tPA و اینترفرون گاما - با استفاده از روشهاي الایزا و ایمینو پلاتینگ مورد بررسی و آزمایش قرار گرفت. در گیاهان توتون تراریخت میزان 1/12٪ تا 1/63٪ از کل پروتئین محلول را پروتئین نوترکیب VHH تشکیل می داد. این تحقیق اولین گزارش از انتقال و بیان ژن آنتی باید تک دمنی نوترکیب VHH بر علیه آنتی ژن سرطانی در گیاهان توتون میباشد.
مقدمه:
گیاهان تراریخت می توانند به عنوان بیوراکتورهاي زنده براي تولید ارزان مواد شیمیایی و داروئی عمل نمایند که این پدیده به زراعت ملکولی - Molecular farming - معروف میباشد. گیاهان تراریخته نسل چهارم، گیاهانی هستند که با اهداف استفادههاي پزشکی و بهداشتی تولید می شوند. تقاضاي روزافزون براي داروهاي بیولوژیکی و از طرف دیگر قیمت بالاي آنها، دسترسی به آنها را محدود میکند، بنابراین لازم است برنامه ریزي لازم صورت پذیرد که به میزان زیاد و با هزینه کمتر در دسترس مردم قرار گیرند. مهندسی ژنتیک گیاهان به منظور تولید داروهاي بیولوژیکی موضوع جدیدي است که فواید بالقوه زیادي دارد:
- 1 سیستم گیاهی بسیار اقتصادي تر از سیستمهاي صنعتی - بیوراکتور یا تخمیر - میباشد.
- 2 مقدار محصولات نوترکیب تولید شده در گیاهان میتواند با مقیاس صنعتی برابري و حتی بیشتر باشد.
- 3 در این روش خطرات ناشی از آلودگی با عوامل بیماريزا انسانی یا بیماریهاي مشترك به حداقل می رسد.
- 4 گیاهان را میتوان طوري جهتدهی کرد که پروتئینهاي سنتز شده به اندامکهاي داخل سلولی که در آنجا پایداري بیشتري دارند، هدایت شوند و یا حتی این پروتئینها مستقیما در اندامکهاي خاصی - مثل کلروپلاست - بیان شوند. کشاورزي مولکولی داراي پتانسیل بالایی در تولید نامحدود آنتی بادي هاي نوترکیب، واکسن ها، جایگزین هاي خونی، فاکتورهاي رشد و آنزیم ها می باشد و در حال حاضر در جهان یک پذیرش عمومی براي تولید این پروتئین هاي نوترکیب از طریق گیاهان بوجود آمده است - . - 11
با توجه به اهمیت کشاورزي ملکولی در آینده اقتصاد جهانی، پروژه بزرگ تولید پروتئنهاي نوترکیب در گیاهان طراحی و در حال اجراست. این پروژه در قالب چهار رساله دکترا و سه پایان نامه کارشناسی ارشد موفق گردیده: ژنهاي آنتی بادي منوکلونال VHH، پروتئین نوترکیب tPA و اینترفرون گاما را به گیاهان توتون و کلزا منتفل نماید.
طی سال هاي اخیر در دانشگاه تربیت مدرس تلاش هاي موفقیت آمیزي در جهت تهیه آنتی باديهاي نوترکیب علیه تومور صورت گرفته و براي اولین بار تولید آنتی بادي هاي تک دومنی نوترکیب علیه 1MUC1 از منشاء شتر تک کوهانه و دو کوهانه انجام شده است - 1و. - 3 با توجه به نیاز مراکز درمانی و تشخیصی، در این تحقیق از گیاه توتون به عنوان یک منبع مناسب براي تولید آنتیبادي نوترکیب تک دومنی علیه MUC1 استفاده شده است.
پروتئین نوترکیب tPA و استرپتوکینز امروزه بصورت دارو براي از بین بردن لخته هاي موضعی خون و درمان بیماریهاي سکته قلبی ومغزي استفاده می شوند ولی مزیتی که پروتئین نوترکیب tPA دارد اختصاصی تر عمل کردن آن است، ولی عیبی که این دارو دارد گرانی نسبی آن است طوریکه هر بار درمان آن هزینه اي در حدود 2900 دلار در بر دارد که اگر بتوان این دارو را در گیاه تولید کرد - - 4 با توجه به مزایایی که این سیستم بیانی دارد هزینه درمان بسیار کاهش خواهد یافت هر چند مزایاي دیگر این سیستم را نیز نباید فراموش کرد.
اینتروفرون ها براي مصارف درمانی متعددي مورد مطالعه قرار گرفته اند. اینترفرون β براي درمان Relapsing type multiple sclerosis و اینترفرون γ براي درمان بیماري Chronic granulomatous مورد تایید قرار گرفته است با توجه به فعالیتهاي بیولوژیکی متعدد اینترفرونها و ارزش درمانی آنها، تلاش زیادي در جهت تولید انبوه آنها از طریق بیولوژي مولکولی، بیوشیمی و تکنیکهاي مهندسی ژنتیک صورت گرفته است.
مواد و روشها :
باکتریها : در این آزمایشها از دو باکتري Esherichia coli - با نژادهاي TG1 و - DH5α و Agrobacterium tumefaciens - با نژادهاي LBA4404 و - - C58 - PGV3101 استفاده شد. از نژادهاي باکتري E. coli به عنوان میزبان براي نگهداري و تکثیر ساختارهاي تهیه شده استفاده گردید و از آگروباکتریوم جهت انتقال ژن مورد نظر به گیاه توتون استفاده شد.
ناقلها : ناقل فاژمیدي pCANTAB 5E و ناقل بیانی گیاهی pBI121 که داراي ژن مقاومت به کانامایسین، پیش برCaMV 35S و توالیهاي خاتمه دهنده نسخهبرداري بود.
گیاهان توتون : در این آزمایش گیاه توتون - Nicotiana tabacum - کولتیوار Xanthi استفاده گردید.
نتایج و بحث:
در بخشی از پروژه بزرگ تولید پروتئین هاي نوترکیب تلاش گردید پس از کلون کردن ژن مذکور وانتقال آن به گیاه توتون هماکنون به کارخانه - بیوراکتور - این ماده موثره تبدیل گردد. ریزنمونه هایی گیاهان توتون تیپ وحشی که با باکتري - Agrobacterium - tumefaciens حاوي پلاسمید pBI121 داراي ژنهاي مورد نظر - VHH، tPA و اینترفرون گاما - ، تلقیح شده بودند بر روي محیط کشت انتخابی حاوي کانامایسین و سفاتاکسیم گیاهچه هاي جدید را تولید کردند - - A در حالیکه درگیاهان شاهد - تلقیح با آگروباکتریوم بدون - pBI121 هیچگونه تولید گیاهچه اي مشاهده نشد - .
گیاهچه ها در محیط کشت انتخابی حاوي کانامایسین با غلظت 25 میلی گرم در لیتر - C - و50 میلی گرم در لیتر - - D باززایی شدند. گیاهچه هاي رشد کرده به شیشه هاي بزرگتر حاوي کانامایسین - با غلظت 50 میلی گرم - در لیتر و سفاتاکسیم - با غلظت 200 میلی گرم در لیتر - منتقل شدند . - E - گیاهان توتون به گلدانهاي حاوي ورمیکولایت منتقل شده وسپس انتقال نهایی به خاك انجام گرفت - - F1,F2 واز گیاهان تراریخت بذر گرفته شد.
آنالیز گیاهان تراریخت:
آنالیز در سطح :DNA از گیاهانی که در روي محیط هاي ریشه زایی حاوي کانامایسین نمونه هاي برگی تهیه و DNA گیاهی به روش Rapid DNA extraction استخراج و با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی ژنهاي مورد نظر - VHH، tPA و اینترفرون گاما - ، واکنش PCR انجام شد.
- آنالیز :ELISA واکنش پروتئین استخراج شده از برگهاي جوان گیاهان تراریخت نسبت به آنتی ژن مورد نظر با استفاده از روش ELISA مورد بررسی قرار گرفت و نشان داد که تفاوت واکنش ایمنی زایی قابل ملاحظه اي در پروتئین هاي گیاهان تراریخت باززایی شده نسبت به گیاهان غیرتراریخت و همچنین NSB وجود داشت. جدول1 تفاوت OD450nm را براي نمونه هاي مورد آزمایش نشان میدهد.
