بخشی از مقاله
چکیده
این تحقیق به منظور بدست آوردن روشی ساده براي کشت سلول هاي باله دمی تاسماهی ایرانی انجام شد. در این تحقیق قسمت انتهایی باله دمی سه عدد تاسماهی ایرانی سه ساله پس از ضدعفونی کردن با الکل اتانول %70 با قیچی استریل بریده شد و بعد از شست وشو با بتادین و سه بار شست و شو با محیط کشت استریل حاوي آنتی بیوتیک به قطعات یک میلیمتري تقسیم شد. سپس هر 10 -15 قطعه باله در یک پتري دیش به همراه سه میلی لیتر محیط کشت L-15 با pH = 7.3 حاوي - 25mM - HEPES، پنی سیلین جی پتاسیم - 100 I.u./ml - و استرپتومایسین - 100 µg/ml - قرار داده شدند.
نمونه ها در دماي 20 درجه سانتیگراد و اتمسفر معمولی نگهداري و به طور روزانه از لحاظ آلودگی بررسی شدند. انتشار سلول ها از بافت به محیط در روز چهارم در زیر میکروسکوپ اینورت قابل مشاهده بود و پس از گذشت حدود دو هفته لایه سلولی در کف ظرف کشت تشکیل شد که مجددا قابل کشت - ساب کالچر - بود. به طور میانگین، %65/12 از قطعات باله پس از انتقال به پتري دیش موفق به چسبیدن به کف ظرف کشت شدند و ازدیاد سلول ها در آن ها دیده شد. در این تحقیق همچنین نشان داده شد که کشت تاخیري سلول ها با نگهداري 48 ساعته نمونه هاي جداشده از باله دمی در محیط کشت باعث کاهش درصد چسبندگی و تکثیرسلول ها - - %48 می شود.
مقدمه
سلولی یکی از ابزارهاي مهم بیوتکنولوژي می باشد . - 9 - برخی مزایاي این روش مانند امکان کنترل کامل محیط و ترکیبات آن و در نتیجه حذف استرس هاي ناخواسته و امکان انجام کل آزمایش بر روي یک محتواي ژنی براي از میان برداشتن اثر ژنوم متفاوت و نیاز کمتر به موجودات زنده و مکان و نیروي کار براي انجام آزمایش باعث افزایش علاقمندي در بکارگیري این تکنیک شده است . - 10 -
این تکنیک در سال هاي اخیر در زمینه هایی چون بیولوژي سلولی، فیزیولوژي، سم شناسی، ژنتیک، بهداشت و بیماري ها و تولید تجاري واکسن هاي ویروسی و پروتئین ها مورد استفاده قرار گرفته است. اهمیت آبزي پروري در تامین غذاي جمعیت رو به رشد جهان باعث تلاش محققان در استفاده از روش هاي جدید براي مدیریت بهداشتی مزارع و افزایش اطلاعات در مورد مکانیسم هاي متابولیکی و فیزیولوژي آبزیان پرورشی در جهت بهبود روش هاي پرورشی و افزایش کیفیت تولید شده است، که تکنیک کشت سلول هاي آبزیان پرورشی از جمله این روش ها می باشد.
در این میان باله ماهیان بدلیل داشتن توان باززایی و امکان نمونه برداري بدون آسیب رساندن به ماهی و دارا بودن تمام محتواي ژنی ماهی مورد توجه محققان قرار دارد. از کشت سلول هاي باله در بررسی آسیب پذیري ماهی نسبت به ویروس ها - 12 - ، سنجش آستانه تحمل حرارتی - 5 - ، مطالعه توان باززایی سلول هاي باله - 4 - و بدست آوردن کاریوتایپ - 11 - استفاده شده است .
از طرف دیگر از آن جا که این سلول ها داراي محتواي ژنی ماهی هستند در زمانی که گامت و لارو در دسترس نیست، می توان از این سلول ها براي تهیه بانک ژنی - 3 - استفاده کرد. کشت هاي باله را می توان پس از انجماد براي مدت طولانی نگهداري کرد. با توجه به اهمیت کشت سلولی و کاربرد هاي آن و عدم تجربه قبلی در مورد کشت باله تاسماهی ایرانی این تحقیق به منظور دستیابی به روشی ساده براي تهیه کشت اولیه سالم با توانایی تکثیر از سلول هاي باله ماهی ماهی مذکور انجام شد.
مواد و روش ها
به منظور کشت باله دمی تاسماهی ایرانی ابتدا محیط کشت L–15 حاوي - 25mM - HEPES، پنی سیلین جی پتاسیم - 100 I.u./ml - ، استرپتومایسین - 100µg/ml - با pH = 7.3 تهیه و استریل شد. سپس با یک عدد قیچی ضدعفونی شده با اتانول %70 ، حاشیه انتهایی باله دمی 3 عدد تاسماهی ایرانی 3 ساله موجود در بخش تکثیر انستیتوتحقیقات بین المللی ماهیان خاویاري دکتر دادمان رشت بریده شد و به منظور کشت به آزمایشگاه ژنتیک منتقل گردید. در آزمایشگاه، قطعات باله دمی در شرایط استریل به مدت 10 دقیقه با بتادین و 3 بار براي مدت 10 -5 دقبقه با محیط کشت استریل شست و شو داده شدند.
سپس به کمک اسکالپر استریل نمونه ها به قطعات یک میلی متري بریده شدند و به تعدادي پتري دیش منتقل شدند - تعداد 15 -10 تکه در هر پتري دیش - و حدود یک میلی لیتر محیط کشت حاوي FBS %50 به آنها اضافه شد. سپس نمونه ها تا صبح روز بعد در انکوباتور با دماي 20 درجه سانتیگراد نگهداري شدند. روز بعد مقدار 2 میلی لیتر محیط کشت تازه حاويFBS %20 به آنها افزوده شد و قطعات شناور در محیط کشت از پتري دیش خارج شدند. نمونه ها به طور روزانه از نظر آلودگی بررسی شدند و محیط کشت نیز دو بار در هفته تعویض شد.
این روش بر روي سه ماهی و با سه بار تکرار انجام گرفت 2 - و 3و . - 4 گاهی اوقات امکان انتقال ماهی از مزرعه به آزمایشگاه براي نمونه برداري میسر نمی باشد. در این گونه مواقع می توان نمونه جداشده از باله ماهی را در محلول بافر و یا محیط کشت نگهداري کرد و در اسرع وقت به آزمایشگاه رساند. در این بررسی اثر تاخیري 48 ساعته در کشت دادن نمونه بریده شده از باله دمی ماهی بر روي درصد موفقیت کشت مورد سنجش قرار گرفت. نمونه شاهد بلافاصله بعد از جداشدن کشت داده شد و نمونه هاي دیگر براي مدت 48 ساعت در محیط کشت حاوي FBS %20 نگهداري و سپس کشت داده شدند . - 3 -
نتایج و بحث
گسترش سلول ها از قطعات بافت به محیط در حدود 5 -4 روز بعد در زیر میکروسکوپ اینورت قابل مشاهده شدند - شکل هاي 1، . - 2 تعداد سلول هاي تکثیر یافته با مرور زمان افزایش پیدا کرد و بعد از گذشت تقریبا دو هفته، % 80 کف ظرف کشت را پوشاندند و امکان تهیه زیرکشت - ساب کالچر - از آن ها فراهم شد. در کشت اولیه سلول هاي اپی تلیال و فیبروبلاست مشاهده شدند. سلول ها در کشت هاي بعدي اغلب فیبروبلاست بودند.
توانایی سلول هاي قطعات باله ماهی در چسبیدن به کف ظرف کشت و به دنبال آن توان تکثیر شدن سلول ها معیار سنجش درصد موفقیت کشت انجام شده، بود. بر همین اساس بیشترین درصد بدست آمده 83/3 %، کمترین درصد 33/3 %، و درصد موفقیت کشت با این روش به طور میانگین % 65/12 بود. تاخیر در کشت موجب کاهش درصد موفقیت کشت شد. بیشترین درصد بدست آمده %70 و کمترین درصد %14/28 بود و میانگین موفقیت %48 بدست آمد.
محیط کشت روز ھفتم
توانایی چسبیدن قطعات بافت کشت داده شده به کف ظرف و انتشار سلول ها از آن ها به محیط کشت روشی براي سنجش فرآیند کشت است که پیش از این توسط Silvestre و همکاران - 6 و7 و - 8 بر روي قطعات پوست پستانداران اهلی و Maugar و همکاران - 3 - بر روي قطعات باله ماهی طلایی بکارگرفته شد. در این تحقیق نیز از همین روش براي سنجش میزان موفقیت کشت سلولی باله دمی تاسماهی ایرانی A. persicus کمک گرفته شد. در این روش در طی 4 الی 5 روز اول می توان میزان موفقیت کشت را تشخیص داد و نیازي نیست تا 2 الی 3 هفته براي بدست آوردن زمان دو برابر شدن صبر کرد.
محیط کشت و پروتکلی که مورد استفاده قرارگرفت، در تمامی موارد درصد رشد خوبی را بدست داد، هرچند که در هیچ یک از موارد به موفقیت کامل منتهی نشد. در زمینه کشت سلولی به ویژه کشت سلول هاي ماهیان روش هاي متفاوت با محیط هاي کشت مختلف بکارگرفته شده اند که نتیجه بسیاري از آن ها موفقیت آمیز بوده است. در این بررسی، به علت در دسترس نبودن انکوباتور مجهز به سیستم کنترل کننده فشار دي اکسید کربن، کشت در اتمسفر معمولی انجام شد.
محیط کشت استفاده شده به فشار دي اکسید کربن وابسته نبود. با این وجود، مشکلات افزایش قلیاییت که به دلیل محتواي بی کربنات محیط رخ می داد با افزودن HEPES تعدیل شد. محیط هایی که در ساخت آن ها از محلول نمکی Hank استفاده شده است غالبا براي استفاده در اتمسفر معمولی مناسب هستند . - 1 - در مواردي امکان انتقال ماهی به آزمایشگاه براي نمونه برداري میسر نمی باشد که این امر می تواند به علت فاصله موجود بین مزرعه و آزمایشگاه و یا زیاد بودن تعداد ماهیانی که باید از آن ها نمونه گیري شود، باشد.
در هر حال، در اینگونه موارد لازم است که نمونه در محلولی مناسب نگهداري شود تا سلول ها توان زنده مانی و تکثیر خود را از دست ندهند. براي این کار از محیط کشت حاوي FBS %20 استفاده گردید. در مطالعه حاضر، با تاخیر در کشت نمونه هاي جداشده از بدن ماهی، درصد موفقیت با کاهش همراه بود ولی Mauger و همکاران گزارش کردند که درصد موفقیت کشت نمونه هایی که 72 ساعت پس از جدا شدن از باله ماهی طلایی در محیط کشت حاوي FBS % 20 نگهداري شده اند - %69 - از نمونه هایی است که بلافاصله کشت داده شده اند - %48 - بیشتر است . - 3 -
به این ترتیب به نظر می رسد که در صورت نبود امکان انتقال ماهی به آزمایشگاه، نگهداري نمونه در محیط کشت حاوي FBS %20 می تواند مناسب باشد. روش به کارگرفته شده در این مقاله زمانی می تواند کارآمد باشد که در مورد سایر گونه ها نیز جواب هاي مشابهی را بدست دهد. به نظر می رسد که با توجه به سایر کارهاي انجام شده، در صورت تامین درجه حرارت مورد نیاز گونه هاي مختلف و اندکی تغییرات در جهت سازگاري شرایط کشت با گونه بتوان از این روش براي سایر گونه ها نیز استفاده کرد.
