بخشی از مقاله
چکیده
کارتنوئیدها یکی از گسترده ترین کلاس هاي ترکیبات غذایی از لحاظ تنوع غذایی هستند. نقش کاربردي کارتنوئیدها در تغذیه انسان به عنوان آنتی اکسیدان و پیش ماده ویتامین A سبب شده که مصرف پیوسته آنها موجب ایمنی در برابر تعدادي از بیماریها گردد. بنابراین به خاطر اهمیت کارتنوئیدها، دستکاري ژن هاي رمزکننده ي آنزیم هاي مسیر سنتز این مواد از اهمیت فوق العاده اي برخور می باشد .
این طرح براي بررسی پتانسیل گیاه خوراکی کاهو براي افزایش میزان کارتنوئیدها از طریق بیان بیشینه ي کلیدي ترین آنزیم مسیر سنتز کارتنوئیدها، یعنی فایتوئین سنتاز، انجام می گیرد. براي اینکار ابتدا cDNAي ژن فایتوئین سنتاز که از گیاه نرگس جداسازي گردیده است، در وکتور مخصوص انتقال ژن به هسته از طریق تفنگ ژنی، کلون گردید.
همچنین این ژن در وکتورهاي مخصوص انتقال ژن به کلروپلاست قرار می گیرد تا انتقال ژن به هر دو اندامک هسته و کلروپلاست انجام پذیرد. از آنجا که کشت بافت و اندامزایی اساس موفقیت در هر آزمایش انتقال ژن و بویژه در انتقال ژن به کلروپلاست می باشد، بنابراین، ما روش بسیار کارآمدي براي کشت بافت و باززایی از قطعات برگ، براي چندین واریته کاهو نیز ابداع کردیم. آزمایشات اولیه از طریق انتقال و بیان موقت ژن gus با استفاده از تفنگ ژنی، موید پتانسیل بالاي قطعات برگ براي انتقال ژن با این روش می باشد.
مقدمه
در طبیعت موادي به نام پیش سازهاي ویتامین A وجود دارند که کاروتن از جمله آن ها می باشد. فایتوئین سنتاز آنزیمی است که در نهایت سبب تولید یک کارتنوئید به نام -βکاروتن می شود که پیش ماده ویتامین A است . - 2 - بیوسنتز کارتنوئید در پلاستید روي می دهد در حالیکه تمامی آنزیم هاي شناخته شده در این مسیر در هسته کد می شوند . - 7 - کارتنوئیدها مولکول هاي ایزوپرنوئیدي هستند که توسط تمامی ارگان هاي فتوسنتز کننده سنتز می شوند و از طرفی نیز گروهی از رنگدانه هاي مهم گیاهی هستند.
این مواد از جمله گسترده ترین متابولیت هاي ثانویه در گیاهان هستند که در دریافت نور و حفاظت نوري گیاه نقش دارند . - 3 ,2 - کارتنوئید ها به عنوان پیش ماده براي بیوسنتز هورمون آبسزیک اسید که در واقع یک تنظیم کننده رشد گیاهی است مطرح می باشند -β . - 4 - کاروتن در بدن انسان شکسته و تبدیل به ویتامین A می شود . در سا ل هاي اخیر تلاش هاي زیادي در زمینه مهندسی متابولیکی به منظور افزایش خواص مواد غذایی از لحاظ ویتامین A صورت گرفته است.
کمبود ویتامین A در انسان یک مشکل جهانی است که یک سوم از کشور هاي جهان را درگیر کرده و هر ساله تقریبا 250-500 هزار نفر به علت کمبود ویتامین A بینایی خود را از دست می دهند. علاوه بر آن، کمبود این ویتامین سبب ضعیف شدن سیستم ایمنی بدن شده و افزایش شیوع و شدت بیماري هاي عفونی را به همراه دارد . - 4 - در دهه اخیر تلاش هاي زیادي در جهت کاهش کمبود این ویتامین در سطح جهانی صورت گرفته است.
در کنار آموزش تغذیه صحیح، غنی کردن مواد خوراکی از -β کاروتن ازطریق مهندسی گیاهان، از جمله کارهایی بوده که صورت گرفته است. ژن فایتوئین سنتاز - PSY - ، یک آنزیم کلیدي در مسیر سنتز کارتنوئیدها میباشد. مطالعات زیادي نشان داده اند که این ژن نقش بسیار مهمی در تنظیم سنتز کارتنوئیدها بازي میکند. بطوریکه، در چندین مورد، افزایش بیان این ژن با استفاده از مهندسی ژنتیک، باعث افزایش میزان کارتنوئیدها و بویژه بتا کاروتن شده است . - 6 ,1 - بنابراین، هدف از این طرح بررسی اثر بیان بیشینه ي این آنزیم در افزایش میزان کارتنوئیدها در کاهو می باشد.
مواد و روشها:
در این طرح از cDNAي ژن فایتوئین سنتاز که قبلا توسط Schledz و همکاران - 5 - کلون گردیده بود، استفاده شد. براي تهیه وکتور مناسب براي انتقال ژن به روش تفنگ ژنی، کاست حاوي ژن PSY تحت کنترل پروموتر 35S ویروس موزائیک گل کلم - CMV - در وکتور pGreen0029 کلون گردید. این وکتور حاوي دو عدد ژن نئومایسین فسفوترانسفراز جهت امکان انجام گزینش در باکتري و گیاه می باشد.
براي انتقال ژن به کلروپلاست، با توجه به تشابه بسیار بالاي توالی ژنوم پلاستیدي در دو گیاه توتون و کاهو در ناحیه مورد نظر، از وکتور پلاستیدي مخصوص تنباکو استفاده گردید. ژن PSY در پایین دست پروموتر Prrn کلون گردید و کاست بدست آمده به وکتور نهایی که حاوي ژن انتخابگر aadA می باشد، انتقال داده شد. براي بهینه سازي محیط کشت کاهو، محیط پایه MS استفاده شد و ترکیب مختلفی از هورمونهاي BAP، NAA، IAA و Zeatin آزمایش شد تا بهترین ترکیب براي بیشترین اندامزایی تعیین شود. براي بررسی کارآیی انتقال موقت ژن به برگهاي کاهو، از وکتور حاوي ژن gus تحت کنترل پروموتر 35S استفاده گردید. انتقال پایدار ژن به هسته و کلروپلاست به روش ریزپرتابی با استفاده از تفنگ ژنی صورت خواهد گرفت.
نتایج و بحث:
cDNAي ژن PSY گیاه نرگس در وکتور pGreen0029 کلون گردید - شکل . - 1 وکتور حاصل داراي قابلیت تکثیر بالایی در E. coli می باشد و نیز قطعه حاوي PSY به همراه ژن انتخابگر nptII قابل جداسازي می باشد. دیده شده که این عمل براي انتقال ژن با تعداد نسخه هاي کمتر مفید بوده و کارایی انتقال ژن به روش ریزپرتابی را نیز افزایش می دهد. لازم به ذکر است که از این وکتور می توان براي انتقال ژن به کمک آگروباکتریوم نیز استفاده کرد.
شکل -1 وکتور انتقال ژن فایتوئین سنتاز - PSY - به هسته. این وکتور حاوي ژن nptI جهت گزینش گیاهان تراریخته و nptI براي گزینش باکتریهاي تراریخت روي محیط کشت حاوي کانامایسین می باشد. با توجه به اینکه مسیر سنتز کارتنوئیدها در کلروپلاست انجام میگیرد، بنابراین احتمال می رود که بیان آنزیمهاي مربوطه بطور مستقیم در داخل کلروپلاست، در کاهش مصرف انرژي براي گیاه براي انتقال آنزیم از سیتوپلاسم به کلروپلاست مفید باشد.
همچنین با توجه به بالا بودن تعداد نسخه هاي ژنوم کلروپلاست و در نتیجه بیان بالاي آنزیم، می تواند اثر بزرگتري در مسیر سنتز کارتنوئیدها داشته باشد. بنابراین، ژن PSY در یک وکتور مناسب براي انتقال ژن به کلروپلاست نیز کلون گردید. بر اساس نتایج بدست آمده از بررسی توالیهاي ژنوم کلروپلاست توتون و کاهو، ژنوم کلروپلاست این دو گیاه تشابه بسیار زیادي در منطقه توالی تکراري معکوس - Inverted repeat: IR - دارند. بنابراین، ژن PSY در وکتورهاي کلروپلاستی مخصوص تنباکو کلون گردید.
از آنجا که سیستمهاي کارآمد کشت بافت و باززایی یکی از اساسی ترین مراحل فرآیند انتقال ژن، بویژه براي کلروپلاست، می باشد، بنابراین، ما ب یک سیستم کشت بافت کارآمد براي باززایی مستقیم گیاه از قطعات برگ یا کوتیلدون گیاه کاهو بهینه کردیم. این روش بسیار کارآمد بوده و میزان پاسخ به باززایی گیاه هم براي برگ و هم براي کوتیلدونها %100 می باشد - شکل . - 2 شکل -2 اندامزایی مستقیم از قطعات برگ کاهو. باززایی در کل سطح قطعات برگ مشاهده می شود. در مرحله بعد، انتقال ژن PSY به هسته و کلروپلاست به روش ریزپرابی انجام خواهد گرفت. سپس میزان تغییرات در کارتنوئیدهاي مختلف مطالعه خواهد گردید.
