بخشی از مقاله
DNA پلیمراز ها آنزیم هایی هستند که سنتز رشته DNA را از دزوکسی ریبو نوکلئوتید ها کاتالیز می کنند. DNA پلیمراز Pfu یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت از خانواده B می باشد. این آنزیم از یک آرکئوباکتري بی هوازي و بسیار گرما دوست به نام پیروکوکوس فوریوسوس جدا گردیده است. مزیت اصلی این آنزیم دقت بالاي آن نسبت به آنزیم Taq پلیمراز می باشد.
در این مطالعه DNA ژنومی باکتري با استفاده از روش هاي مختلف استخراج و پس از تایید نتایج استخراج، ژن پلیمراز Pfuتوسط آغازگر1 هاي اختصاصی و واکنش PCR تکثیر شد. محصول PCR درون پلاسمید هاي pTZ57R و pET-15b کلون گردید و پس از تایید توالی آن درون سویه ي DH5 α باکتري E. coli ترانسفورم گردید. رنگ سیاه محیط کشت و بوي سولفید هیدروژن نشان دهنده رشد میکرو ارگانیسم بود . واکنش PCR باندي در حدود 2300 bp را نتیجه داد. پس از ترانسفورم، کشت باکتري چندین کلونی ایجاد کرد که بیشتر آنها داراي پلاسمید حاوي ژن بودند.
مقدمه
DNA پلیمراز ها نقشی اساسی در همانند سازي و تعمیر DNA سلولی بر عهده دارند. این آنزیم ها در آزمایشگاه براي اهداف بیولوژیکی از جمله توالی یابی2DNA و واکنش زنجیره اي پلیمراز1 استفاده می شوند - DNA . - 11 پلیمراز ها بر اساس ارتباط فیلوژنی و همولوژي بینشان به 7 خانواده تقسیم می شوند. این 7 گروه شامل خانواده هاي A-B-C-D-X-RT و Y هستند.
خانواده DNA :A پلیمراز هاي باکتري هاي گرما دوست و بسیار گرما دوست مثل DNA پلیمراز Taq و DNA پلیمراز I باکتري E. coli، خانواده DNA :B پلیمراز هاي آرکئا مثل DNA پلیمرازPfu ، خانواده :C مثل زیر واحد آلفاي DNAپلیمراز III باکتري E. coli ، خانواده :D مثل پلیمراز II یوکاریوتی، خانواده :X مثل DNA پلیمراز β یوکاریوتی، خانواده :RT ترانس کریپتاز معکوس2 و خانواده :Y مثل TLS پلیمراز می باشند - . - 5 تفاوت این 7 خانواده در ساختار، نوع شناسایی سوبسترا، فعالیت و دقت می باشد - . - 7
درمورد استفاده از پلیمرازها در واکنش PCR ابتدا از قطعه کلنو3 - آنزیم تعدیل شده اي که با حذف قطعهاي شامل 323 اسیدآمینه از DNA پلیمراز І به دست میآید - استفاده می گردید. مشکل استفاده از این آنزیم کاهش خاصیت پلیمرازي آن پس از هر بار حرارت دادن بود و به ناچار پس از هر بار چرخه PCR مقداري آنزیم مجددا به واکنش افزوده میشد.
با کشف DNA پلیمرازهاي مقاوم به حرارت این چنین مشکلات عملی در کار حل شد. زیرا این آنزیم ها می توانستند در چرخه هاي PCR فعالیت خود را حفظ کنند - DNA . - 8 پلیمراز هاي Taq و Pfu از جمله DNA پلیمرازهاي مقاوم به حرارت اند که می توان در واکنش PCR از آنها استفاده کرد - . - 3 DNA پلیمراز Taq از نوعی مایکوباکتریوم گرما دوست به نامThermus aquaticus به دست میآید - . - 13 این پروتئین 94 کیلو دالتونی دو فعالیت کاتالیتیکی DNA پلیمرازي و اگزونوکلئازي 5' به 3' را داراست - . - 12 عیب اصلی این آنزیم فقدان فعالیت اگزونوکلئازي 3' به 45' میباشد که باعث عدم اصلاح خطاهاي ناشی از فعالیت پلیمرازي آنزیم می شود - . - 4
DNA پلیمراز Pfu دیگر DNA پلیمراز مقاوم به حرارت میباشد که از یک آرکئوباکتري بسیار گرما دوست به نام پیروکوکوس فوریوسوس5 جدا گردیده است - . - 6 این آنزیم که 90 کیلو دالتون وزن مولکولی دارد در زیر مجموعه خانواده B پلیمراز ها قرار دارد - . - 7 این آنزیم فعالیت تصحیح کنندگی اگزونوکلئازي 3' به 5' را دارا میباشد که باعث بالا بردن صحت سنتز DNA میشود - . - 2 میزان خطا در سنتز DNA با این آنزیم 7-10 برابر کمتر از DNA پلیمراز Taq گزارش شده است. در عین حال سرعت پلیمرازي این آنزیم نسبت به DNA پلیمراز Taq کمتر است - . - 10
این تفاوت در میزان خطا و سرعت به خصوصیت ساختاري این دو پلیمراز بر می گردد. عموما DNA پلیمراز ها از لحاظ ساختاري داراي 3 جزء انگشتان، کف دست و شست می باشند - 7 و . - 1 حضور بخش هاي دیگر در ساختار یک پلیمراز از جمله بخش اگزونوکئازي براي یک همانند سازي بدون خطا در بین DNA پلیمراز ها متفاوت است.
آن چنان که DNA پلیمرازهاي آرکئا مثل DNA پلیمراز Pfu داراي 5 بخش انگشتان، کف دست، شست، -Nترمینال و اگزونوکلئازي می باشند که بخش اگزونوکلئازي موقعیت خود را بر اساس حالت همانند سازي یا تصحیح کنندگی تغییر می دهد - . - 9 براي ژن هاي تکثیر شده براي اهداف بیان صحت توالی بسیار اهمیت دارد براي چنین ژن هایی استفاده از DNA پلیمراز Pfu بسیار مفید و ضروري می باشد.
مواد و روش ها
باکتري ها، وکتور ها، آنزیم ها، محیط هاي کشت
- DSM 3638 - Pyrococcus furiosus از کلکسیون میکروبی آلمان - DSMZ - تهیه شد. سویه DH5 α باکتري ,E. coli وکتور هاي pTZ57R و pET-15b از شرکت سیناژن خریداري شدند. آنزیم هاي محدود گر BamHI و NdeI، آنزیم Taq DNA-polymerase و سایر مواد واکنش PCR، آنزیم آلکالن فسفاتاز، مارکر DNA و کیت استخراج پلاسمید از شرکت فرمنتاز آلمان تهیه شدند.
کیت استخراج DNA ژنومی از موسسه A&A Biotechnology لهستان تهیه شد. آمپی سیلین از شرکت سیگما آلمان خریداري شد. کیت استخراج DNA از ژل از شرکت کیاژن آلمان تهیه شد. محیط کشت ATCC medium : 1915 Pyrococcus medium جهت کشت Pyrococcus furiosus، محیط LB حاوي 100μg /ml آمپی سیلین براي کشت سویه ي E. coli استفاده شدند.
کشت و استخراج DNA
Pyrococcus furiosus در محیط کشت مخصوص باکتري - ATCC medium 1915 - در دماي 96درجه سانتی گراد و در شرایط بی هوازي کشت داده شد. براي ایجاد شرایط بی هوازي هواي داخل لوله ها ي کشت به کمک گاز نیتروژن و پیپت پاستور تخلیه شد و لوله ها در جار بی هوازي قرار داده شد.DNA ژنومی باکتري با استفاده از کیت Genomic DNA Prep Kit - A&A Biotechnology,Poland - و روش آنزیمی استخراج شد.
واکنش PCR در حجم کلی 1 μl -DNA Template 6 μl –d H2O 33/5 μl - 50 μl از هر پرایمر - dNTP 1 μl 5 μl -Mix بافر - Taq DNA polymerase 1 μl - MgCl21/5 μl - PCR انجام شد. پس از الکتروفورز محصول PCR و تخلیص آن توسط کیت استخراج DNA از ژل، حاصل با استفاده از دو آنزیم BamHI و NdeI و DNA لیگاز در وکتور pTZ57R کلون گردید. پس از تأیید توالی ژن پلیمراز Pfu، پلاسمید درون سویه DH5 α باکتري E. coli ترانسفورم شد.
سپس وکتور بیانی pET-15b و پلاسمید pTZ57R تحت برش با آنزیم هاي BamHI و NdeI قرار گرفتند. پس از انجام الکتروفورز ژل آگاروز و استخراج DNA از ژل و دفسفریلاسیون وکتور بیانی pET-15b توسط آنزیم آلکالن فسفاتاز، ژن پلیمراز Pfu با استفاده از آنزیم DNA لیگاز در وکتور بیانی pET-15b کلون گردید. ترانسفورماسیون درون سویه DH5 α باکتري E. coli پس از تایید توالی صورت گرفت.
نتایج و بحث
پیروکوکوس فوریوسوس در شرایط بی هوازي رشد کرد. رنگ سیاه محیط کشت و بوي H2S نشان دهنده ي رشد موفق میکروارگانیسم بود. در زیر میکروسکوپ نیز میکروارگانیسم هاي کروي مشاهده شد. DNA ژنومی پس از آزمودن روش هاي مختلف استخراج شد. واکنش PCR به تکثیر قطعه اي منجر شد که پس از الکتروفورز ژل آگاروز باندي حدودي 2300bp را نتیجه داد - شکل . - 1 کلونینگ ژن در وکتورpTZ57R با موفقیت همراه بود. توالی آن با توالی ژن پلیمراز Pfu موجود در سایت - Accession Nr. P61875 - NCBI مطابقت داشت.
