بخشی از مقاله
خلاصه
سلولهاي دندرتیکی از طریق عرضه آنتی ژن در سطح خود و تحریک سلولهاي T نقش مهمی در کنترل سیستم ایمنی بازي میکنند. این عمل از طریق مولکولهاي فعال MHC، مولکولهاي کمک تحریک کنندهCD40 یا CD80/86 ویا سایتوکاینهاي محلول انجام می شود. بررسیها نشان میدهد که عدم حضور مولکولهاي کمک تحریکی موجب ایجاد آنرژي سلولی ویا تمایز به سمت سلول هاي T helper می گردد.
بر این اساس براي بلوك کردن مولکولها وایجاد تحمل ایمنی استراتژیهاي طراحی گردیده است. در این ارتباط مولکول CD40 هدف بسیار مناسبی است . به عنوان اولین گام جهت تعیین کمیت مولکول CD40 از روش کمیت سنجی نسبی با متد Real Time PCR استفاده گردید. به وسیله طراحی پرایمرهاي مناسب، Asymmetric Real Time PCR، گرادیان دمایی توام با Real Time PCR وتغییرات در مرحله جمع آوري اطلاعات درنرم افزار، واکنش بهینه با بازدهی در محدوده .%91-117 وشیب منحنی در حدود-%3/5 تایید گردید.
مقدمه
سلولهاي دندریتیک یکی ازمهمترین سلولهاي عرضه کننده آنتی ژن و شرکت کننده در کنترل پاسخ ایمنی هستند .این سلولها از طریق سه دسته پیام در فرآیند فعال شدن سلولهاي T دخیل هستند. نخست اینکه از طریق بیان بالاي مولکولهاي MHC در سطح خود باعث عرضه آنتی ژن به سلولهاي T می شوند. ثانیا از طریق مولکولهاي کمک تحریکی که در سطح غشاء بیان می شوند - مانند CD40 ,CD80/86,OX-40L - سلولهاي T را تحریک می کنند و سوم این که از طریق تولید سیتوکاینهاي محلول باعث تحریک تمایز سلولهاي T به سمت فنوتیپ Th1 وTh2 می شوند.
در عدم حضور مولکولهاي کمک تحریکی در سلولهاي دندریتیکی، سلولهاي T دچار آنرژي، مرگ سلولی و یا تمایز به سمت Th2 و یا سلولهاي T تنظیمی می گردند. در میان مولکولهاي کمک تحریکی CD40 از اهمیت بالاتري برخوردار بوده و مانند یک کلید مولکولی در واکنش سلولهاي دندریتیکی وT عمل می کند. براي ایجاد تحمل ایمنی در بدن امروزه از استراتژیهاي مختلفی جهت بلوك کردن این مولکول استفاده می کنند.
در حقیقت به وسیله بلوك کردن این مولکول از پاسخ سلولهاي T ممانعت بعمل آمده و همچنین سلولهاي T تنظیمی تولید می شوند. هدف این بررسی طراحی روشی مناسب، حساس و دقیق در جهت اندازه گیري بیان مولکول CD40 می باشد .از این طریق میتوان بررسیهاي حذفی این ژن را بخوبی مورد پایش قرار داد . در این میان روش انداره گیري نسبی بیان ژن quantification - به روش Real time PCR بهینه سازي و ارائه گردید.
مواد و روشها
سلولهاي دندریتیک از طحال موش به روش هضم آنزیمی جداشده و در محیط گرادیان نایکودنز تخلیص و خلوص آن بوسیله مارکر CD11C با روش فلوسیتومتري تعیین گردید .سلول BCL-1 به عنوان کنترل مثبت ژن CD40 انتخاب گردید. RNA سلولها با استفاده از کیت RNeasy plus mini kit مربوط به شرکت Qiagen استخراج شد .
پرایمرهاي ژن CD40 وADA با استفاده از نرم افزار Beacon designer 7.0 طراحی و موقعیت آن نسبت اگزون و اینترونها توسط برنامه Spidey - www.ncbi.nlm.gov/spidey - تعیین شد. ساختمان هاي ثانویه با برنامه mfold مشخص گردیده و در نهایت بوسیله برنامه blast مورد آنالیز قرار گرفتند .آنالیز Realtime PCR با استفاده از کیت یک مرحله Invitrogen انجام شد و یا بعد از ساخت cDNA در حضور Oligo dT با کیت IQ syber green supermix شرکت BIORAD انجام پذیرفت.
نتایج
به منظور بهینه سازي روش Real time –PCR با استفاده از کیت یک مرحله اي Invitrogen با روش Syber green توسط دستگاه MyiQ شرکت BioRad بررسی آغاز گردید. به منظور ایجاد شرایط یکنواخت در یک آزمایش دیگر ساخت cDNA به روش Oligo dT وآمپلیفیکاسیون به کمک محلول Syber green supermix بیوراد انجام شد و این روش مناسب تر تشخیص داده شد.
شیب منحنی و ضریب باز دهی براي CD40 و - adenosine deaminase - ADA در طی بررسیهاي مختلف Realtime-PCR تعیین و از طریق آزمایش با پارامترهاي چون Asymmetric PCR براي پرایمر مستقیم و معکوس، تغییر درسیستم کسب اطلاعات دستگاه از نقطه انتهاي دماي - 72Cœ - extension به84 Cœ و آنالیز توام گرادیان حرارتی و شیبی معادل -3/5 و بازدهی %97 بهینه سازي گردید - شکل - 1
بحث
RNase protection assay,Northern blot وRT-PCR امروزه به عنوان روشهاي مختلف ارزیابی بیان ژن معرفی شده اند . مقایسه این تکنیک ها حساسیت پائین، عدم تکرار پذیري و حد دینامیکی پائین آنها را نشان می دهد.روش Real time –PCR از طریق محاسبه CT بعنوان پارامتري حساس جایگاه ویژه خود را پیدا نموده است. شرط اساسی در محاسبات کمیت سنجی نسبی، انتخاب ژن پایه مادر نسبت به ژن هدف و بازدهی یکسان آنها نسبت به یکدیگر است. این مسئله در محاسبات بعدي و معادلات کمیت سنجی نسبی حائز اهمیت است. در این تحقیق این عمل از طریق تغییرات مناسب برا ي ارزیابی بیان ژن CD40 در سلول هاي دندریتیک اعمال گردیده و جهت بررسی هاي بعدي بهینه گردید.
