بخشی از مقاله

چکیده

در این تحقیق، نمونه برداری از خاک شالیزار و اندام های هوایی برنج در مناطق مختلف استان گیلان انجام شد و جدایه های آنتاگونیست Trichoderma harzianum با استفاده از محیط کشت انتخابی PDA جداسازی و خالص شد. برای بررسیهای کنترل بیولوژیک از روش کشت دوتایی، متابولیتهای فرار و روش کشت روی اسلاید استفاده گردید. درکشت دوتایی جدایه T. harzianum در مهار رشد میسلیومی R. solani موفق بود. مشخص گردید که در روش متابولیتهای فرار T. harzianum در مهار رشد میسلیومی R. solani موفق بود. در روش کشت روی اسلاید جدایه T. harzianum در مهار ریسههای R. solani موفق نبود.

-1    مقدمه:

علیرغم پیشرفت های زیادی که در دهه های گذشته بوقوع پیوسته است، جهان هنوز در بحران غذایی به سرمیبرد. این مساله بویژه در مناطقی که با افزایش چشمگیر جمعیت روبرو هستند، مهم است - Mcspaddan & Fravel, 2000 - برنج بخشی کلیدی از امنیت جهانی غذا را تشکیل می دهد، به طوری که این گیاه جزء اصلی رژیم غذایی روزانه بیش از 3میلیارد نفر مخصوصاَ در آسیا می را تشکیل میدهد - . - Mcspaddan & Fravel, 2002

برنج بدون شک مهمترین گیاه غذایی در جهان شمرده میشود که تولید سالانه آن در سال 2007 معادل 598 تن گزارش شد - . - Mcspaddan & Fravel, 2002 برنج برخلاف دیگر غلات به جز بعضی از محصولات فرآوری شده آن نظیر سبوس و کاه، تقریباَ به طور انحصاری به تغذیه بشر اختصاص داده شده است - Lee & . - Rush,1983 سازمان غذا و خوار و بار سازمان ملل متحد - فائو - تخمین زده است که حدود 517 میلیون تن از محصول برنج که حدود 86 درصد از تولید کل میباشد به منظور مصرف مستقیم انسان مورد استفاده قرار می گیرد - . - Ou., 1985

کشت برنج در ایران نیز به حدود 400 سال قبل از میلاد بر می گردد و در مناطق بابل و شوش در ایران قدیم کشت می شده است. سابقه کشت آن در زمان هخامنشی، اشکانیان و ساسانیان در گیلان، مازندران و خراسان و همچنین بخش هایی از کاشمر و تاشکند معمول بوده است - نیک نژاد و شریفی تهرانی، . - 1372 ایران تنها 0%/4 مساحت زیر کشت برنج جهان را در اختیار دارد که تقریباَ 75 درصد آن در استان های گیلان، مازندران و خراسان قرار دارد - کاظم زاده و همکاران، . - 1391 اهمیت برنج در رژیم غذایی مردم ایران از درجه بالایی برخوردار است و غالباَ برنج را به صورت های مختلف در برنامه غذایی خود استفاده می کنند.

با رشد جمیعت و تغییر ذائقه مردم در گرایش به برنج میزان مصرف آن نیز همچنان در حال فزونی می باشد و با این روند احتمال میرود که در سالهای آتی به عنوان منبع اصلی تامین کالری مردم ایران مورد توجه قرار گیرد. بر اساس آمارهای جهانی، آفات، بیماری های گیاهی و علف های هرز حدود یک سوم تولید محصولات کشاورزی دنیا را نابود می کنند - . - Agrios, 2005

خسارات وارده به غلات و بخصوص به برنج در کشورهای توسعه یافته و توسعه نیافته تفاوت های چشمگیری داشته ولی در مجموع بین یک سوم تا یک چهارم تولید را شامل میشود . - Agrios, 2005 - گیاه برنج مورد حمله حدود هفتاد پاتوژن قارچی، باکتریایی، ویروسی، شبه -مایکوپلاسمایی و نماتدی قرار می گیرد که در این میان عوامل بیماریزای قارچی بالاترین فراوانی را دارا هستند.

در ایران مهمترین بیماری ایجاد کننده خسارت در برنج بیماری بلاست برنج است و بیماری سوختگی غلاف در رتبه دوم قرار دارد که عامل آن قارچ Rhizoctonia solani می باشد - کاظم زاده و همکاران، . - 1391 این قارچ روی غلاف برگ برنج تولید لکههای بیضیشکل با حاشیه مشخص میکند. همچنین عوامل قارچی دیگری نیز ایجاد لکه بر روی غلاف برگ برنج میکنند که از آن جمله قارچهای Rhizoctonia oryza-sativae عامل لکه موجی غلاف برگ برنج و Sclerotium hydrophilum عامل لکه غلاف برگ برنج هستند که از بیماریزایی کمتری نسبت به عامل اول، برخوردار می باشند - کاظم زاده و همکاران، . - 1391

در میان گونههای ریزوکتونیا Rhizoctonia solaniبه عنوان یک بازیدیومیست خاکزاد که گیاهان زراعی و غیر زراعی متعددی را مورد حمله قرار می دهد گونه ای است که به طور گسترده ای مورد مطالعه قرار گرفته است - Sneh et al, 1991 - . این امر به دلیل خسارت اقتصادی زیاد و دامنه میزبانی وسیع این گونه می باشد . - Ogoshi, 1972 - با این حال هنوز جنبههای مختلفی از این قارچ ناشناخته مانده است و از آن به عنوان Rhizoctonia solani یا A large species complex یاد میشود . - Cubeta & Vilgalys, 1997 - این قارچ هیچ گونه اسپورغیرجنسی - کنیدیوم - تولید نمیکند و تنها گاهی اوقات قارچ قادر به تولید اسپورهای جنسی - بازیدیوسپور - میباشد. بر خلاف بسیاری از بازیدیومیست ها، در این قارچ بازیدیومها در بازیدیوکارپ احاطه نشدهاند . - Adams, 1996 -

-2مواد و روشها

1-2نمونه برداری و جداسازی آنتاگونیستها

در بازدیدهایی که طی ماههای مرداد و شهریور سال 94-93 از شالیزارهای استان گیلان به عمل آمد، در هر مزرعه نمونه برداری از قطعات مختلف برنج از جمله خوشه، ساقه، برگ، غلاف برگ و پای بوتهها انجام شد. نمونهها پس از جمع آوری و درج مشخصاتی مثل محل نمونهبرداری، تاریخ نمونهبرداری، نوع رقم و شماره نمونه، در پاکتهای کاغذی به آزمایشگاه منتقل شدند.

در این بررسی سعی شد از اکثر مناطق برنجکاری استان گیلان از جمله شهرهای رشت، انزلی، فومن، تالش، لاهیجان، لنگرود و روستاهای اطراف استان گیلان نمونهبرداری انجام گیرد. از نمونههای جمعآوری شده، قطعاتی به طول 1-1/5 سانتیمتر از غلافها بریده شد و در میکروتویوپهای 1/5 میلیمتری قرار گرفتند و تا زمان جداسازی عامل بیماری و عوامل آنتاگونیست در فریزر تحت دمای 20 درجه سانتی گراد نگهداری شدند - پاداشت، . - 1380 برای کشت، خالصسازی و نگهداری جدایههای قارچی ازمحیطهای کشت PDA - سیب زمینی، دکستروز، آگار - و آب- آگار - بسته به نوع قارچ جدا شده - استفاده گردید.

در کلیه موارد، عمل استریلکردن این محیط های کشت در دستگاه اتوکلاو - حرارت 120 درجه سانتیگراد، فشار 105 پاسکال و زمان 20 دقیقه - انجام گرفت. برای جلوگیری از آلودگی باکتریایی، مقداری محلول سولفات استرپتومایسین به ارلنهای حاوی محیط کشت اضافه گردید 10 - میلی گرم آنتی بیوتیک در 1 سیسی آب مقطر استریل - .

3بررسی اثر جدایه های آنتاگونیستی روی R. solani در آزمایشگاه 1-3روش کشت دوطرفه - doal culture technigue - در این مطالعات از روش سیواکومار و همکاران - Sivakumar et al., 2000 - استفاده شد. برای این منظور یک دیسک میسلیومی به قطر 5 میلیمتر که از قسمت-های حاشیهای کشت 5-7 روزه Rhizoctonia solani گرفته شده بود در زیر هود استریل درون یک تشتک پتری 8 سانتیمتری حاوی PDA به فاصله 2سانتی-متری از دیواره تشتکپتری قرار داده شد.

سپس تشتکپتری به مدت 48 ساعت در انکوباتور با دمای 26 درجه سانتیگراد نگهداری شد تا قارچ مورد نظر رشدش را آغاز نماید، سپس یک دیسک میسلیومی به قطر 5 میلیمتر که از کنارههای کشت 5-7 روزه قارچهای دیگر گرفته شده بود، در فاصله 3 سانتیمتری از قارچ بیماریزا قرار گرفت. تشتکهای پتری در دمای 26 درجه سانتیگراد قرار داده شدند و اندازهگیریها بعد از 7-10 روز انجام گرفت - شکلهای 2-3و. - 3-3

در شاهدهای بیمار، یک دیسک میسلیومی از کنارههای کشت 5-7 روزه Rhizoctonia solani درشرایط استریل در مرکز یک تشتک پتری 8 سانتیمتری قرار گرفت. تشتکهای پتری شاهد نیز در انکوباتور با دمای 26 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. در پایان دوره انکوباسیون، رشد R. solani در شاهد و تیمار اندازهگیری گردید. کاهش رشد شعاعی در ارتباط با شاهدها براساس فرمول زیر محاسبه گردید: =  −  × 100× مهار رشد مسیلیومی% که C میزان رشد شعاعی Rhizoctonia solani در تشتکهای پتری شاهد و Tرشد شعاعی R. solani درحضور قارچهای دیگر است - Sivakumar et al., . - 2000 آزمایش در قالب یک طرح کاملا تصادفی با 5 تیمار و 3 تکرار انجام گرفت.

2-3بررسی مایکوپارازیتیسم جدایه های آنتاگونیست علیه R. solani

قرصهای پنچ میلیمتری از میسلیومهای R. solani در یک طرف لام سترون موجود در تشکهای پتری 9 سانتی متری و پوشش داده شده با یک لایه نازک آب آگار دو درصد قرار داده شدند و به مدت 48 ساعت در انکوباتور با دمای 26 درجه سانتیگراد نگهداری گردیدند. سپس در طرف دیگر لام سترون، قرصهای پنج میلیمتری از حاشیه کشت سه روزه از آنتاگونیستها قرار گرفت. در اسلاید شاهد فقط قرص میسلیومی بیمارگر قرار داده شد و از روز سوم به بعد بررسی های میکروسکوپی انجام گرفت . - Bell et al., 1982 -

3-3اثر متابولیتهای فرار آنتاگونیست در رشد R. solani

این آزمایش مطابق روش دنیس و وبستر - Denis & Webster , 1971 - انجام شد. قرصی به قطر پنج میلی متر از حاشیهی کشت جوان سه روزهی R. solani در وسط یک تشتک پتری حاوی محیط کشت PDA قرار داده شد . 48 ساعت بعد قرصی به قطر پنج میلیمتر از حاشیه کشت جوان سه روزهی آنتاگونیستها در وسط یک تشتک پتری دیگر حاوی محیط کشت PDA قرار گرفت.

سپس در پوشهای تشتکهای پتری مربوط به جدایههای تریکودرما و بیمارگر در شرایط سترون برداشته شدند و تشتک حاوی R. solani به طور وارونه روی تشتک تریکودرما قرار گرفت. در تشتکهای پتری شاهد، قرصی از محیط کشت PDA جایگزین آنتاگونیست شد. درصد ممانعت از رشد بیمارگر پس از 5 و7 روز توسط جدایههای آنتاگونیست با استفاده از رابطه A-A\B × 100 محاسبه شد. A و B به ترتیب نشان دهندهی قطر پرگنهی بیمارگر در شاهد و تیمار بودند.

-4شناسایی گونههای آنتاگونیست

پس از شناسایی مقدماتی همه جدایههای قارچی به دست آمده در سطح جنس، تعداد 47 جدایه قارچی برای مطالعات بیماریزایی و مطالعات کنترل بیولوژیک در آزمایشگاه انتخاب و از میان این جدایهها، 2 جدایه برای مطالعات گلخانهای انتخاب گردید و مورد ارزیابی بیشتر و شناسایی در سطح گونه قرار گرفت. اساس شناسایی آنها مبتنی بر صفات مورفولوژیکی همچون شکل کلنی، رنگ کلنی، نحوه رشد میسلیوم، منفرد یا گروهیبودن کنیدیوفور، ابعاد و رنگ کنیدیوفور، طول و عرض کنیدی و تعداد دیوارههای عرضی کنیدیها و... بود. بر اساس صفات فوق دو گروه قارچی شناسایی شدند که عبارتند از:

Rifai Trichoderma harzianum1 -4

کلنیها دارای رشد سریع بوده و بعد از سه روز قطر آنها روی محیط کشت PDA به هفت تا نه سانتیمتر میرسید. ریسههای هوایی کرکی، سفید تا متمایل به زرد بودند. کنیدیومزایی غالبأ به صورت پراکنده در تمام سطح محیط کشت انجام گردید. کنیدیومزایی گاهی بهصورت دوایر متحدالمرکز یا متراکم در نزدیک حاشیه تشتکها غالبا بهصورت تودههای بزرگ نامنظم بههم پیوسته انجام میگردید. سطح جوشها به صورت دانه دانه یا پودری به نظر میرسید و حاشیه آنها اغلب به وسیله ریسههای عقیم احاطه شده بود.

جوشها ابتدا به رنگ سبز متمایل به زرد ظاهر شدند. کلنیها کمی بوی خاک میداد . یا بویی از آنها متصاعد نمیشد. کنیدیوفورها بیرنگ، دارای دیواره صاف، راست یا قابل انعطاف بودند. کنیدیوفورها خیلی منشعب و شاخههای اولیه با زاویه راست منشعب شده یا به طرف نوک متمایل شدند. انشعابات معمولا به صورت دستههای 2تا 3 تایی و پیرامونی روی کنیدیوفور تشکیل میشدند.

شاخههای اولیه به طرف پایه بلندتر و مجددا منشعب شده و شاخههای ثانویه روی آنها بهصورت 2 تا 4 تایی پیرامونی تشکیل شدند - شکل . - 1 فیالیدها آمپولیشکل تا تقریبأ کروی یا تنگیشکل بودند . فیالیدها غالبأ روی شاخههای انتهایی در دستههای 2 تا 6 تایی بطور پیرامونی بهوجود میآمدند. کنیدیومها تقریبأ کروی تا تخم مرغی وارونه بودند. کنیدیومها در انتهای فوقانی گرد و در پایه باریک و قدری نوکدار بودند. سطح کنیدیومها صاف و بهرنگ سبز روشن تا بیرنگ بود. اندازه کنیدیها 1/7-2/3 ×1/3-2/5 بود. مشخصات این گروه از جدایه ها با گونه Trichoderma harzianum مطاقبت داشت . - Rifiai, 1963 -

در متن اصلی مقاله به هم ریختگی وجود ندارد. برای مطالعه بیشتر مقاله آن را خریداری کنید