بخشی از مقاله
چکیده
یکی از مهمترین پاتوژنهای با منشا غذایی اشرشیاکلی O157:H7 است که عامل ایجاد بیماریهای رودهای و مسمومیت غذایی برای انسان میباشند. لاکتوباسیلها بهطور طبیعی در اغلب مواد غذایی وجود دارند و برخی مواد رشد آنها را تحریک میکنند. هدف از این مطالعه استفاده از لاکتوباسیل روتری همراه با عصاره آبی فلفل سیاه و EDTA در مهار اشرشیاکلی O157:H7 است.
ابتدا اثر تحریکی عصاره آبی فلفل سیاه بر رشد لاکتوباسیلوس روتری در چهار غلظت 0/5 ، 1، 2 و mg/ml 4 بررسی شد، سپس اثر مهاری لاکتوباسیلوس روتری بهمراه عصاره آبی فلفل سیاه و 50 - EDTA میلی مولار - بر اشرشیاکلی O157:H7 در مدت زمان صفر، 4، 8 و 24 ساعت ارزیابی شد.
نتایج نشان داد که دو غلظت 2 و mg/ml 4 عصاره آبی فلفل سیاه بیشترین اثر تحریکی را بر رشد لاکتوباسیلوس روتری داشتند، بطوری که بعد از 48 ساعت انکوبهگذاری لاکتوباسیلوس روتری با غلظت اولیه 7 لگاریتم در گروه کنترل که فقط لاکتوباسیلوس روتری بود به 8/73 لگاریتم و بهمراه غلظت 2 و mg/ml 4 عصاره آبی فلفل سیاه به ترتیب به 9/53 و 9/72 لگاریتم رسید، همچنین لاکتوباسیلوس روتری بهتنهایی توانست 1/1 لگاریتم رشد پاتوژن اشرشیاکلی O157:H7 را مهار کند، درحالیکه لاکتوباسیل روتری بهمراه عصاره آبی فلفل سیاه با غلظت 2 و mg/ml 4 و EDTA، توانست به ترتیب 2 و 2/4 لگاریتم رشد این پاتوژن را مهار نماید. با توجه به نتایج این مطالعه، میتوان از لاکتوباسیلها بهمراه عصاره آبی فلفل سیاه و EDTA بهمنظور کنترل زیستی اشرشیاکلی O157:H7 استفاده کرد و بعلاوه از سایر مزایای لاکتوباسیلها نیز بهرهمند شد.
مقدمه :
باکتریهای اسیدلاکتیک یکی از گروههای پروبیوتیک میباشند که بهعنوان میکروارگانیسمهای با منشاء غذایی مطرح اند. باکتریهای اسیدلاکتیک، باکتریهایی گرم مثبت و کاتالاز منفی هستند که بعد از تولد در دستگاه گوارش یافت میشوند - . - 1 لاکتوباسیل ها غیر اسپورزا و میکروآئروفیل اند و در شرایط بیهوازی بهخوبی رشد میکنند و تقریباً همه جا وجود دارند - . - 2 تاریخچهی استفاده از میکروارگانیسمهای زنده در غذا بهویژه باکتریهای تولیدکننده اسیدلاکتیک بهمنظور حفظ و بهبود سلامت انسان بسیار طولانی است. 76 سال قبل از میلاد مسیح، مورخ رومی استفاده از فرآوردههای تخمیری شیر را بهمنظور درمان گاستروآنتریت توصیه نمود
باکتری های اسیدلاکتیک گروه وسیع و متنوعی از باکتریها هستند ویژگیهای فیزیولوژیک مشابهی داشته و همه آنها بهطور ذاتی توانایی تخمیر و تبدیل کربوهیدراتها را به اسیدلاکتیک دارند. رشد آنها به دلیل توانایی محدود در بیوسنتز و نیاز فراوان آنها به منابع کربن و ازت در همهی مواد غذایی امکانپذیر نیست و عمدتاً در مواد خام گیاهی و حیوانی، مواد غذایی تخمیری، پوست حیوانات و غشاهای مخاطی یافت میشوند . - 4 - باکتریهای اسیدلاکتیک مواد ضد میکروبی طبیعی متعددی را تولید میکنند ازجمله این مواد عبارتاند از اسیدهای آلی مانند اسیدلاکتیک، اسید استیک، اسید فرمیک، انواع باکتریوسین، روترین و روتروساکلین. این مواد میتوانند رشد باکتریهای پاتوژن مانند اشرشیاکلی، لیستریا مونوسیتوژنز و...را مهار کنند
پروبیوتیکها در فرآوردههای گوشتی بهعنوان کشتهای حفاظتی علیه باکتریهای عامل بیماریزا استفاده میشوند. اثر کنترل زیستی پروبیوتیکها در فراوردههای گوشتی عمدتاً مربوط به تولید باکتریوسین توسط گونههای لاکتوباسیل و انتروکوکوس است. با توجه به تنوع فراوری گوشت، عوامل مؤثر در بقای میکروارگانیسمهای پروبیوتیک در فراوردههای مختلف متفاوت هستند؛ بنابراین بهمنظور افزایش کارایی استفاده از پروبیوتیکها در فراوردههای گوشتی، داشتن اطلاعات کامل از شرایط محصولی که در آن پروبیوتیک استفاده میشود، اهمیت دارد
میکروارگانیسمهای پروبیوتیک بهطور گسترده به فراوردههای گوشتی خام بهعنوان عامل حفاظت زیستی اضافه میشوند برای مثال انتروکوکوس فکالیس با موفقیت علیه عوامل بیماریزا ازجمله اشرشیاکلیO157:H7، لیستریا مونوسیتوژنز و کلستریدیوم پرفرنجس در گوشت چرخکرده گاو آزمایش شده است
یکی از نگرانیهای اصلی در ایمنی غذا انتقال عوامل بیماریزای انتروباکتریاسه، به دلیل شیوع بالای بیماریهای با منشاء غذایی و ظهور سروتیپهایی با حدت بیشتر و راههای انتقال آنها است. شیوع بیماریهای مرتبط با مصرف محصولات تازه بهطور فزایندهای افزایش یافته است. باکتریهای بیماریزا ممکن است محصولات تازه را از طریق گردوخاک، فضولات حیوانی، کود، آب آبیاری، آلودگی متقاطع از آب فراوری یا پس از برداشت محصول آلوده کنند
کنترل عوامل بیماریزا با منشاء غذایی در محصولات تازه مشکل است چون کمترین تیمارها را میتوان اعمال نمود تا ویژگیهای ظاهری غذاها و طول مدت ماندگاری را تحت تأثیر قرار ندهد. از باکتریوسینهای باکتریهای اسیدلاکتیک در ترکیب با سایر سیستمهای ترکیبی بهصورت تکنولوژی هاردل12 میتوان بهمنظور غیرفعال کردن عوامل بیماریزای گرم منفی در غذاها بهمنظور القاء آسیب به سلول و به همریختگی قسمتی از لایه حفاظتی بیرونی استفاده نمود
یکی از اعضای خانواده انتروباکتریاسه ها و از جمله مهمترین پاتوژنهای با منشا غذایی اشرشیاکلی O157:H7 است که عامل ایجاد بیماریهای رودهای و مسمومیت غذایی برای انسان میباشند. اشرشیاکلی عمدتاً بهعنوان بخشی از فلور طبیعی رودهی انسان و بسیاری از حیوانات خونگرم محسوب میشود. این باکتری بهعنوان عضو خانوادهی انتروباکتریاسه خصوصیات عمومی این خانواده را دارد. این ارگانیسم کاتالاز مثبت، اکسیداز منفی، دارای قابلیت انجام تخمیر، میلهای کوتاه، گرم منفی و غیر اسپورزاست
فلفل سیاه با اسم علمی Piper nigrum میوه گیاه بالاروندهای است که ساقه نیمه چوبی در ریشههای ساقه خیز دارد و به کمک این ریشههای نابجا نیز به درختان مجاور خود، بهمنظور ادامه نوعی زندگی همزیستی یا انگلی با آنها، اتصال پیدا میکندفلفل سیاه بهعنوان " طلای سیاه" یا " پادشاه ادویهجات" شناختهشده است؛ که تقریباً در تمام دنیا در مواد غذایی، بهعنوان دارو در داروسازی و در ترکیبات حشره کش ها استفاده میشود. فلفل سیاه به دلیل دارا بودن خواص ضد میکروبی و آنتیاکسیدانی نقش مهمی در فرآوری مواد غذایی و افزایش عمر نگهداری آن ها دارد
لذا از اسانس و عصاره فلفل سیاه بهعنوان یک نگهدارنده طبیعی در مواد غذایی بهمنظور افزایش عمر نگهداری و بهبود خواص حسی و طعم دهندگی میتوان استفاده کرد - 12 - ، بعلاوه فلفل سیاه دارای یک سری ترکیبات پریبیوتیک است که میتواند رشد پروبیوتیکها را تحریک کند - 13 - در پزشکی از ترکیبات فلفل سیاه به اشکال مختلف به منظور کاهش درد، کاهش التهاب و داروهای اشتهاآور استفاده میشود
EDTA - اتیل دی آمین تترا استات - یک شلاته گر است که باعث برداشت و شلاته کردن کاتیونهایی مانند Ca2+و Mg2+ از لایه لیپوپلی ساکاریدی شده و پایداری و ثبات غشای خارجی باکتریهای گرم منفی ازجمله اشرشیاکلی را به هم میزند و باعث تخریب و نابودی آنها میشود
تحقیقات نشان میدهد که باکتریوسینهای تولیدشده توسط باکتریهای اسیدلاکتیک بر روی باکتریهای گرم مثبت نسبت به باکتریهای گرم منفی تأثیر مهارکنندگی بهتری دارند که به دلیل غشای خارجی باکتریهای گرم منفی است که در باکتریهای گرم مثبت وجود ندارد، بااین حال اگر باکتریوسینها همراه با یک عامل شیمیایی که غشای خارجی را مختل کند اضافه شوند برای مثال عامل شلاتهکننده مانند EDTA، باکتریهای گرم منفی میتوانند نسبت به برخی از باکتریوسینها حساس شوند
مواد و روش کار :
تهیه عصاره آبی فلفل سیاه
فلفل سیاه خشکشده از بازار ادویه فروشان سنندج تهیه شد، ناخالصی های آنها جدا و سپس توسط آسیاب برقی خرد گردید. 100 گرم از پودر حاصل را با یک لیتر آب مقطر مخلوط کرده و به مدت یک ساعت رفلاکس شد. عصاره حاصل در چندین مرحله صاف شد، ابتدا عصاره¬ها از تامپون عبور داده شد تا ذرات درشتتر گرفته شود، سپس عصارهها با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره 42 و پمپ 2 بار فیلتر گردید. عصاره صاف شده در دستگاه روتاری تغلیظ شد و سپس لیوفیلیزه شدند. نمونه های حاصل بهصورت پودری درآمده و تا زمان آزمایشها در دمای یخچال و در تاریکی نگهداری شدند. به نمونههای حاصل عصاره آبی داغ گفته می شود
بررسی اثر تحریکی عصاره آبی فلفل سیاه بر روی رشد لاکتوباسیلوس روتری
غلظتهای مختلف از عصاره ی آبی فلفل سیاه 0/5 - ، 1، 2 و 4 میلیگرم بر میلیلیتر - تهیه شد، در هر لوله 4/8 میلیلیتر MRS براث ریخته شده و به آن 100 میکرو لیتر از عصاره تهیه شده و 100 میکرو لیتر از لاکتوباسیل روتری - - cfu/ml107 خریداریشده از مرکز پژوهشهای صنعتی ایران، اضافه شد. لولهها را به مدت 24 ساعت در جارهای بیهوازی استریل شده محتوی گاز پک نوع C انکوبه شدند. سپس رقتهای مختلف از لولهها تهیه شد و بر روی MRS آگار در 3 تکرار کشت داده و بعد از 24 ساعت تعداد کلنیها شمارش شد . - 18 - با توجه به نتایج بهدستآمده، غلظت 2 و 4میلیگرم بر میلیلیتر عصاره آبی فلفل سیاه برای تیمارهای ترکیبی مرحلهی بعد انتخاب شدند.
بررسی اثر مهاری عصاره آبی فلفل سیاه، لاکتوباسیل روتری و EDTA بر رشد اشرشیاکلیO157:H7 در شرایط آزمایشگاهی به منظور بررسی اثر مهاری ترکیب عصاره آبی فلفل سیاه، لاکتوباسیل روتری و EDTA بر روی رشد اشرشیاکلی O157:H7 در شرایط آزمایشگاهی در 10 لوله آزمایش تیمارهای زیر بررسی شد. لازم به ذکر است که در این مطالعه از 50 EDTAمیلی مولار و باکتری اشرشیاکلی 105 - cfu/ml - و لاکتوباسیلوس روتری cfu/ml 107 استفاده گردید - 10 . - 19 تیمار مورد نظر به شرح زیر است:
تیمار BHI :1 براث + - 4/9 ml - اشرشیاکلی - 100 ʽl - O157:H7
تیمار BHI :2 براث + - 4/8 ml - اشرشیاکلی - 100 ʽl - EDTA + - 100 ʽl - O157:H7
تیمار BHI :3 براث + - 4/8ml - اشرشیاکلی+ - 100 ʽl - O157:H7 عصاره آبی فلفل سیاه - 100 ʽl - mg/ml 2
تیمار BHI :4 براث + - 4/8 ml - اشرشیاکلی+ - 100 ʽl - O157:H7 عصاره آبی فلفل سیاه - 100 ʽl - mg/ml 4
تیمار BHI : 5 براث + - 4/8ml - اشرشیاکلی+ - 100 ʽl - O157:H7 لاکتوباسیلوس روتری - 100 ʽl -
