بخشی از مقاله
چکیده
ارزیابی مستقیم ناهه گن تعداد ذرات که سیستم های انتقال داروی نانومتریک هستند ،از جمله : لیپوزوم ها ، به علت اندازه و داشتن حامل بودن ،مشکل است . تاثیر نسبت و ترکیب لیپودیک برروی استحکام فیزیکی لیپوزوم ها در هنگام نگه داری ازطریق روش میکروسکوپی نیروی اتم (AFM ) و اسکتروسکوپی همبستگی فوتون ( ( PCS مورد بررسی قرار گرفت . لیپوزوم ها ازترکیب لیپیدهای مختلف ساخته شده و با استفاده از روشهای متفاوت و مجزای آماده سازی به دست می آیند . تصاویر AFMپس از رسوب گیری نمونه برروی سطح میکابه
دست می ایند و آبدانک ها ی کروی شکل می گیرند . در مدت هفت ماهی که آزمایش انجام شد، میانگین اندازه های لیپوزم های مختلف با استفاده از دو روش قابل مقایسه بودند . براساس آنالیز PCS ،تصاویرAFM نشان داد که تقریبا سیستم های مختلف آبدانه ای گرایش دارند که در هنگام ذخیره سازی ،توده ها شکل دهند . با افزایش ارزش شاخص پلی دیس پرسیتی می توان استحکام تضعیف شده را قوی کرد . حالات متفاوتی که مشاهده می شود ،بیشتر از روشهای آماده سازی لیپوزوم ، به ترکیبات لیپیدی نسبت داده شده اند در نتیجه روش AFM به علت نسبی بودن برای کنترل تکنولوژی میزان پراکندگی و ترسیم فاکتورهای آماده سازی مفید است .
مقدمه :
لیپوزوم ها ابدانک کلوئیدی هستند که از طریق هیدارتاسیون قشرهای نازک حشک شکل می گیرند . فسفولیپیدها به طور معمول برای آماده کردن این سیستم ها استفاده می شوند . به طوریکه خود به خود د رمحلول آبی انباشته شده و یک یا چندین لیپید دو لایه ای را می سازند که این دو لایه ایی ، هسته آبی را در برمی گیرد . اکثر اوقات لیپوزوم ها به عنوان یک فرمول استفاده می شود . بادر نظر گرفتن شیمیایی بودن نسبی آنها از لیپیدهای بیودگردبل و بیوکوم پتیبل می توان بسیاری از داروها به صورت کپسول در آورده که به همین روش محصولات دیگری از جمله :داروهای نیرو بخش روانی ،داروهای ضد قارچی و ضد سرطانی تولید شده اند . (گولاتی -1988 . لیان وهو -2001 ) از اساسی ترین محدودیتهای فرمول
لیپوزوم ها ناپایداری آنهاست . علت ناپایداری شیمیایی آنها به دلیل فرایند ترکیب اکسیژن با اسیدهای چربی اشباع نشده و استربوندهایی است که از طریق آب تجزیه شده اند . در حالی که ناپایداری فیزیکی این لیپوزوم ها به خاطر نشست دارو و انبوهش ویا پراکندگی آبدانک هاست که ذرات بزرگ رامی سازند این ناپایداری ها بروی حالات بافت زنده ی لیپوزوم ها تاثیر می گذارد . از این رو نیاز است که قبل از به کار بردن فرمول لیپوزومال برای درمان های دارویی، تحقیقات بسیاری انجام می گیرد . مواردی چون کوچکی ، تک پاشیدگی و آبدانکهای مقاوم برای آماده سازی بهینه نیاز هستند چرا که غلظت پلاسمهای دارویی لیپوزوم های بزرگ ممکن است به سرعت از طریق سیستم reticulondo the lial (Res) کاهش یابد و در
نتیجه این لیپوزوم هاتخلیه شوند مشاهدات ویژگیهای هندسی اندازه و خصوصیات لیپوزوم هادر محیط آبی در کاربرد پتانسیل سیستم ها به عنوان دارو ،از جمله نکاتی هستند که باید به آنها توجه داشت . از این رو راههاو روش های بسیاری از جمله میکروسکوپی وانواع مختلف اسپکتروپی ها ،به عنوان بهترین ابزار برای توصیف لیپوزوم ها به کار گرفته شده اند .
در طي چند سال گذشته كاربرد AFM در زمينه هاي بيوتكنولوژي،وسايل نيمه رسانا ،پليمرها،قشرهاي نازك وسطح كاني و همچنين در زمينه بيولوژيكي ودرارو سازي افزايش يافته است . به عنوان مثال از AFM همواره براي تصويرسازي سطوح باكتريايي (بونارت -2002) ،غلظت پليمر –دي. ان.اي (مارتين -2000 ) نانو پارتيكل هاي چربي جامد (زر محلن -1996 )وتعييرات مورفولوژي ليپوزوم دي.ان.اي .(D.N.A ) استفاده مي شود . AFM يكي از روشهايي است كه در خانواده ميكروسكوپهاي اسكن كننده با قدرت بالايA1 ،اين امكان رافراهم ميكند كه حتي ليپوزومهاي بسيارريز رادرمحيط طبيعي ،بدون هيچ دخل وتصرفي در نمونه آن را ببينيم . به دليل صراحت نسبي AFM ،از اين روش ميتوان براي كنترل تكنولوژي ميزان پراكندگي
استفاده كرد . هدف اين مقاله اين است كه كاربرد AFM را به منظور توصيف ونگهداري استحكام ليپوزوم هاي معلق كلوئيدي بالا ببرد وروش AFM را با اسپكتروسكوپي همبستگي موتون مقايسه كند . همچنين بايد در نظرداشت كه تركيبات چربي ليپوزوم مي تواند بر روي ساختارهاي حمال تأثيربگذارد .به عنوان مثال از چربي ها در قابليت بار گذاري ،ويژگيهاي سلولي و در تقسيم بدني و ليپوزوم معلق در مقدارهاي متفارت استفاده مي شود . دو چربي طبيعي چون فسفاتيد كلين و كلسترول و يكي از معروفترين چربي ها كه كاتيون فعال دارد dimethy
ldioctadecy lammonium bromide مياشد كه معمولاً درآماده سازي ليپوزوم ها به عنوان جزء سازنده ي ليپوزمال استفاده مي شوند .در اينجا بيشتر ما بر روي استحكام ليپوزونهايي كه كاتيون فعال داريم تمركز كرده ايم،چراكه بيشترين سيستم هاي ليپوزومي در كاربردهاي كلينيكي استفاده ميشود . ليپوزومها كاربرد دارند . اطلاعات اضافه ي ديگري در مورد ساختار غشاء وويژگيهاي سطحي آنها مي توان براي توضيح مكانيزم ، كنش متقابل ميان چربي ها ومواد ژنيتيكي مفيد است .
ليپوزومها به روشهاي متفاوتي توليد مي شوند ،از جمله : تركيب ساده آنها با تجزيه وتحليل چربي ، شستشوي soni cotion به مدت طولاني وهموژنيزه كردن به ويژه با استفاده از روشهاي ميكروسكوپي الكترون(معمولاً TEM) ميتوان ميزان پراكندگي وشكل آبدانك ها را به دست آورد. متاسفانه آبدانك هاي فسفرليپيد ممكن است براثر دگرگوني ساختار كه در نتيجه شرايط خلاء زياد وپروسه آلودگي اتفاق مي افتد ،آسيب ببيند.اين نمونه براي مطالعه مواد آلي كه باسيستم هاي زنده ي محلول آبي در ارتباط است ، يك نقص بزرگ محسوب ميشود .
در اين مقاله ،به بيان اطلاعاتي در مورد ابعاد وهمگني آبدانك ها كه با روش اسپكتروكوپي همبستگي فوتون (PCS )و ميكروسكوپي نيروي اتمي (AFM ) به دست آمده ، مي پردازيم . تأثير تركيبات ليپوزومال و پروسه آماده سازي برروي استحكام فيزيكي كلوئيدي مورد بررسي قرار گرفت .
پتانسيل زتال ذرات وظيفه دارند كه از ذرات در يك محيط خاص استفاده كنند . اطلاع از پتانسيل زتاي آماده سازي ليپوزوم به پيش بيني استحكام و
سرنوشت ليوزوم هاي بافت زنده كمك مي كند . از اين رو ، مقدارپراكندگي پلي ديس پرسيتي ها را مي توان با استفاده از PCS به دست آورد ، واز طرف ديگر پتانسيل هاي ليپوزومال هاي معلق در آب وساكاروز در خصوصيات ليپوزوم هانقش دارند .
2- مواد و روشها
2.1 مواد
فسفات كلين زرده تخم مرغ (PC) كه فلوكاي سوئسي آن را به دست آورد بود وكلسترول (chol ) و(pdab) dime thy ldioctadecy lammonium bromide از شركت سيگها- آلدريچ (ميلان ، ايتاليا ) وديگر مواد شيميايي ومواد حلال از منابع استاندارد خود بدون هيچ تصفيه وپالايشي تهيه شده اند . سيستم آبي Q-MILLI-GL ( مپلي پور- بدفورد – ام . اي – ايالات متحدآمريكا ) كه در آب مقطر استفاده مي كند آبي با خالصيت ( M 18)
براي استفاده در اين آزمايشات فراهم مي كند .
2-2 روشها
2.2.1 –آماده سازي ليپوزومها
براي آماده كردن ليپوزوم ها از تركيبات شناخته شده و پروسه ي استاندار استفاده مي شود . به ويژه محلول كلروفوريك كلسترول ،DDAB و PC به مناسبتهاي گوناگون در دستگاه تبخير گردان .تبخير مي شوند تا لايه نازكي بر روي ديواره هاي اطراف كف با اون شكل بگيرد . لايه ليپيديك به مدت سه ساعت در فضاي خشك نگه داشته مي شود وبه منظور بالا رفتن استحكام ليپوزومال در محلول ساكروز 9% (W,V ) و آب تصفيه شده معلق مي ماند . سرانجام كيسلو (2003 ) ثابت كرد كه آبدانك هاي (DPMC ) lcholine
Dimyris t Oylphos phatidy كه در محلول آبي ساكاروز 15% - 5 آماده ميشوند به مدت 32 روز استحكام بهتري دارند .
وهمچنين تحقيقات نشان داده است كه استفاده از محلول ساكاروز ، از رخنه كردن دارو در ميان ليپوزومال هاي دولايه ايي جلوگيري وآبدانك ها در طول پروسه ي خشك شدن با يكديگر تركيب مي شوند (كرو 1997 ) ليپوزوم هاي تك لايه اي كوچك از طريق سه پروسه به دست مي آيند :
از طريق شستشوي sonication ( برلين –آلمان ) به مدت يك ساعت . از طريق هموژنيزه كردن به مدت هفت دقيقه در درجه حرارت 500/20 (آلتراتوراكس 125 ، لابراتور فني كن كل كان – آلمان ) . ودو مرتبه از طريق شستوشوي sonication به مدت ده دقيقه ويا از طريق گردابي(z*3velp ) به مدت پنج دقيقه وسپس شستوشوي sonication به مدت ده دقيقه .
ليپوزوم هاي به دست آمده با عبور كردن از منفذه هاي 0.2 ميلي متري غشا ptfe ،تصفيه مي شوند .
آماده سازي پارامترهاي فرمول ليپوزوم كلوئيدي جدول(1)
روش آماده سازي (نسبتها) تركيبات نمونه
براي كنترل استحكام نمونه . آماده سازي در دماي اتاق ويادر دمايc4 به دوراز نور انجام ميگردد
2.2.2- آناليز اسكتروسكوپي همبستگي فوتون
از PCS براي مشخص كردن اندازه ي آبدانك ها استفاده مي كنند .( زتامستر، ابزارمال ورن ) .در آزمايشاتي كه انجام شد از ليرز به عنوان منبع نوري استفاده شد . اين ليزركه ليرز 4.5MW ناميده ميشود،خروجي با قدرت بالا ي 640nm در5mw دارد . اندازه گيري هاي pcs در زاويه ي 90 را نشان داده شده اند . كار كرد همبستگي از طريق آناليزاتور ذرات ميكروسكوپي pcs مال ورن انجام شد واز تركيب مناسب سه راسته .
(چو-1974 . برن وبكورا – 1976 ) ميانگين قطر وپلي ديس پرسيتي به دست مي آيد . انكساري واقعي دغير واقعي شاخص از 5.5 تا 1059 در نظر گرفته مي شود . نمونه ها در محلولهاي ساكروز 9% (w/v ) وآب تصفيه شده رقيق مي شوند (1:100 ). آزمايشات تكراري برروي نمونه انجام ميشود و براي هر آزمايش سي اندازه گيري انجام مي شود و اطلاعات بر اساس ميانگين+ انحراف معيار بيان مي شود .
2.2.3- تصوير سازي ميكروسكوپي نيروي اتمي "پارك آتوپ روب " انجام شد .
تصاوير AFM از طريق اندازه گيري كنش متقابل نيروهاي بين نوك وسطح نمونه به دست آمده است .(يالامانچيلي -1998 ) .آزمايشات در دماي اتاق ،در زير آب انجام مي شود (C20 ( ودر فشار اتمسفري (mmhg 760 ) به شيوه ي بدون تماس (NC-AFM) انجام گرفت به صورتيكه فضاي بين نوك ونمونه از 10 تاA 100 ونيروي كلي بسيار كم است . اين نيروي كم ، براي مطالعه وبررسي نمونه هالزم و شكل پذير مناسب است . نوكهاي سيليكون مثلثي شكل براي اين آناليز استفاده مي شود .فركانس تشديد كننده ي اين كانتيلور در حدود KHZ300 . به منظور ترسيم ليپوزوم ها ، روش بدون تماس مناسب تر است چرا كه آبدانك ها ،آمادگي كمي براي بار كردن نيروهاي اعمال شده دارند. قبل از آنالیز ، نمونه ها در آب رقیق می شوند .
(1:100 ) تا کمی شاره چسبناک برای تجزیه و تحلیل به دست آورند . حجم ثابت قطره های ریز (40mm ) می باشد که بر روی صفحه کوچک میکا تا قطر 1cm ته نشین می شود . بعد از دو دقیقه برای انتقال دادن آب اضافه از برگه های فیلتر استفاده می کنیم دو نوع تصویر به دست می آید : تصویر اولی تصویر توپوگرافی است و تصویر دومی گه "سیگنال اشتباه " را نشان می دهد این سیگنال اشتباه از طریق مقایسه دو سیگنال به دست آمده اند سیگنال اول ، دامنه ارتعاشات پایه و ئیگر نقطه مبدأ دامنه را نشان می دهد . تصاویری که از این
روش به دست می آید تغییرات سطحی نمونه ها را نشان می دهد اندازه لیپوزوم ها در تصاویری مجزا در خطهای قرار دادی که آبدانک ها ی کوچک را قطع می کند نشان داده شده است برای اندازه گیری بعد لیپوزوم ها ما یک خط را انتخاب کرده و موقعیت هر لیپوزوم را در دو طرف آن محدود می کنیم تمام اطلاعات میانگین اندازه گیری ها در هر آزمایش نشان می دهد .
4 . 2 . 2 – اندازه گیری پتانسیل الکترونیکی :
به منظور بررسی ویژگی های سطحی لیپوزوم ها از آنالیزاتور الکتروفورسیس ذرات زتامستر که مجهز به لیزر 5Mw he-Ne است برای اندازه گیری جنبش الکترونیکی و پراکندگی پتانسیل زتا استفاده می کنند .(ابزار مال ورن ) زتا گسترده حدود تغییرات را در v120 تا 120 – محدود می کند . پارامترهای استروبینگ در مجموعه های زیر قرار می گیرند : تاخیر استروب oo10 – 0 زمان روشن ms 20000 . زمان خاموش ms oo.1 . با استفاده از یک smoluchowslcy ثابت 1.5 از (ka)F مقدار پتانسیل زتا را از جنبش الکتروفورتیک به دست می آوریم . برای این آنالیز ، نمونه در محلول ساکروز و آب تصفیه شده رقیق می شود (100 : 1( ده اندازه گیری مختلف برای هر نمونه انجام می شود .
3- نتایج و مذاکره
3.1 – آنالیز PCS
آنالیز PCS لیپوزوم ها درست بعد از آماده سازی ، باعث می شود که اندازه متوسط آبدانه ها در حدود nm200 باشد و پلی دیس پری سیسمی شاخصی پائین تر از 0.2 را نشان می دهد . این اطلاعات وجود سیستمهای همگن بعدی را متذکر می شود . به ویژه در پروسه تصفیه سازی با عبور از فیلتر PTFE که منفذی با قطر 2.0 mm دارد ، می تواند آبدانک های کوچک یک لایه را تولید کند . میانگین تغییرات که از طریق اندازه گیری PCS به دست آمده در تصویر (1) نشان داده شده است . لیپوزوم ها در C 4 و در دمای اتاق استحکام یکسانی دارند و حتی لیپوزوم هاینمونه های 5 و 6 شاخص متوسط در دمای اتاق بیشتر دوام پیدا می کنند . لیپوزوم های PC از طریق هموژنیزه کردن در درجه حرارت 500/20 (نمونه (1)) استحکام و پایداری بیشتری از خود نشان می دهند . در زمان نگهداری ، لیپوزوم ها توده بزرگی را تشکیل می دهند . افزایش ارزش شاخص پلی دیسپریستی (تصویر(2)) بر درستی این فرضیه ها نیز صحه می گذارد و میدان گستره آبدان های سیستم های کلوئیدی را نشان می دهد .
اندازه(mm)میلی متر
ا ندازه(mm)میلی متر
تصویر 1 : تغییر میزان میانگین که تابع زمان است به روش آنالیز لیپوزومال های کلوئیدی معلق PCS که در دمای C 4 (a) و یا در دمای اتاق )b) نگه داشته شده اند . ارزش متوسط شش آزمایش انجام شده +- انحراف معیار
به عنوان مثال : میانگین اندازه لیپوزوم ها که در دمای اتاق نگه داشته شدند ، با افزایش pc و DDAB در ظرف مدت هفت ماه تغییر ابعادی لیپوزوم های آماده شده در استفاده از PC، DDAB و CHOL(نمونه 3)در مقایسه با لیپوزوم های (نمونه 2) محدود می شوند . استحکام فیزیکی (mol :mol) 1:1 PC/DDAB لیپوزوم های (نمونه 2 ) با افزودن کلسترول زیاد می شود و شکل آن به (mol:mol:mol) 1:1:1 PC/DDAB/CHOL تغییر می یابد . کلسترول به داخل لیپوزوم های دو لایه ای وارد می شود . شارندگی و آبدانه های داخلی لیپوزوم هایی را که بیشتر سفت هستند را تغییر می دهد ، براساس تصویر 1 . میانگین اندازه ی نمونه های 1 و 3 در ظرف مدت هفت ماه در مقایسه با دیگر نمونه ها مقاوم و قابل مقایسه هستند . اگرچه شاخص پلی دیس پریستی (نمونه 3 ) ثابت کرد که با گذشت 4 ماه از نگهداری نمونه های ، ناهمگنی انبوه لیپوزومال بیشتر می شود . سیستم های آبدانک دار که با DDAB و کلسترول به دست می آیند ، در مورد میدان گستره اندازه متوسط از 4.0تا 8.1 mm که به پروسه آماده سازی بستگی دارد ، اطلاعاتی به ما می دهد .(تصویر 1) . ترکیب لیپیدی نمی تواند در مقاومت لیپوزوم ها نقش داشته باشد . جداسازی لیپیدی به دو دسته ی کلسترول و DDAB می تواند ناپایداری و بعد ، از هم پاشیدگی فسفر لیپید را به دنبال داشته باشد .
