بخشی از مقاله
استفاده از نانو فیبرها جهت افزایش پایداری و فعالیت بیوکاتالیستها
چکیده
در این مقاله روش خاصی برای تثبیت آنزیم روی نانو فیبرهای پلیمری مورد بررسی قرار می گیرد. که در آن هسته آنزیم بر روی نانوفیبری که مخلوطی از (poly-styrene-co-malleic-anhydride ) PSMA (poly styrene ) توسط اتصال کووالانسی تثبیت می شود. عمل اتصال توسط گلوترالدئید (glutaraldehyde) و به صورت اتصال شبکه ای انجام شده و طی آن ملکولهای آنزیمی در داخل محلول کنار یکدیگر جمع می شوند. انتظار می رود این اتصال شبکه ای آنزیمها بروی نانو فیبر باعث افزایش پایداری و فعالیت آنزیمی شود. جهت اثبات این موضوع آنزیم بروی نانو فیبر باردار شده که مخلوطی از PS و PSMA است. تثبیت شده است و فعالیت آنها برای نمونه های مختلف مورد آزمایش قرار گرفته است . نتایج بدست آمده نشان می دهد که فعالیت اولیه مجموعه آنزیمی CT هایی که از قبل بصورت شبکه ای به یکدیگر متصل و بروی مخلوط نانو فیبر تثبیت شده اند. برابر بیشتر از حالتی است که تنها یک لایه از ملکولهای آنزیم بروی نانو فیبر مذکور قرار گرفته است. در مورد پایداری سیستم های آنزیمی نیز آزمایشاتی به مدت یک ماه انجام و نتایج با یکدیگر مقایسه شدند که حاکی از پایداری بالای این روش می باشد. این روش جدید می تواند جهت افزایش پایداری وفعالیت آنزیم های تثبیت شده. در سیستم های بیوکاتالیستی بکار گرفته شود و در فرایندهای زیستی و درمان و بیوسنسورها بسیار مفید باشد.
واژه های کلیدی: نانو فیبر پلیمری - پلی استایرن - گلو ترالدئید - تثبیت آنزیمی
مقدمه
آنزیم ها از مجموعه کاتالیستهای خاص به شمار می آیند که پتانسیل بکار بردن آنها به خوبی شناخته شده است ۲-۱]. استفاده از آنزیمها در زمینه های مختلف مانند سنتز مواد شیمیایی، دارویی و کاتالیستهای معمول در فرایندهای غذایی، بیوسنسورها: بیو درمانی اتصال شبکه ای آنزیم پلیمراز، هضم پروتئین در آنالیز پروتئینی پیلهای بیو سوختی رو به افزایش است . با توجه به روش های آزمایش و طراحی های انجام شده، در سیستم های فوق، فعالیت و پایداری آنزیم ها یکی از پارامترهای مهم به منظور استفاده موفق از انها در - .طول فرایند است اخیراً کوشش به منظور استفاده از مواد با ساختار نانو ، شبیه نانو ذرات, نانو لوله های کربنی و نانو فیبرها ۴-۳ در تثبیت آنزیمی روند سریعی را طی کرده است. به صورتی که همه این مواد می توانند مساحت بزرگی را برای اتصال آنزیم ها ایجاد کرده و باعث افزایش فعالیت آنها شوند. از میان این مواد نانو فیبرهای بافته شده الکترونی با ساختارهای مناسب در مقایسه با نانو ساختارهای دیگر پیشنهاد می شوند.[۶-۵ ] ساخت نانو فیبرها، از اتصال پیوسته نانو ذرات و یا نانو لوله های کربنی به روش بافت الکترونی می تواند، نانو فیبرهای طویلی را تولید کند که در فرآوری حصیرهای نانویی و غشاها بکار گرفته شوند. ریسندگی الکترونی، ساده و تنوع پذیر است و به کمک آن و با کنترل دقیق ترکیبات و اندازه فیبرها در یک زمان کوتاه می توان به نانو فیبری از مواد مختلف و با کیفیت مناسب دست یافت.
جیا(Jia) و همکارانش نشان دادند که اتصال کووالانسی آنزیم به نانو فیبرهای پلی استایرن، در حضور مقادیر زیاد آنزیم ایجاد می شود و تنها یک لایه از مولکولهای آنزیم با اتصال کووالانسی بروی نانو فیبر ایجاد می گردد. آنها همچنین نشان دادند که این کار می تواند پایداری و فعالیت آنزیم را در محلولهای غیر آبی افزایش دهد. انتظار می رود که پوشش دادن سطح نانو فیبر توسط مجموعه ای از آنزیم ها که قبلا اتصال شبکه ای شده اند. بتواند شرایط حضور آنزیمی را بیشتر کرده و عاملی برای افزایش فعالیت آنزیمی باشد. در این مقاله روش جدیدی جهت دستیابی به این هدف تشریح شده. که بر اساس پیوند کووالانسی بین هسته آنزیم و نانو فیبر استوار است. برای اتصال شبکه ای ملکولهای آنزیم از محلول (GA) glutaradehyde استفاده میشود عملیات پوشش در روی سطح نانو فیبر توسط پیوند کووالانسی به انجام میرسد، که در شکل (۱) نشان داده شده است. این عمل موجب افزایش فعالیت آنزیمها می گردد.
در این مقاله نشان داده می شود که نانو فیبر ساخته شده از مخلوط PS و PSMA جهت تثبیت انزیم فعالیت و پایداری آنزیم را ارتقا دهد. در طول اندازگیری پایداری آنزیم تمام نمونه های نانو فیبر هایی که آنزیم بروی آنها تثبیت شده تحت شرایط سخت قرار گرفته و نتایج حاکی از عدم محدودیت های انتقال جرم سوبسترا در فرایند جذب و دفع سطحی است .
مواد و روشها
۱. مواد مورد استفاده در تمامی آزمایشات عبارتند از
Glutaraldehyde (GA), PS, CT, PSMA Tetrahydrofuran (THF) (HPLC 99.9%), N-N-dimethylformamide(DMF), N-succinyl-Ala-AlaPro-Phep-Nitro-Anilide (TP(
۲. روش تهیه نانو فیبر از PS یا مخلوط PS و PSMA با استفاده از ریسندگی الکترونی: محلول پلیمری در دمای اتاق و با نسبت وزنی ۱:۲ برای PSMA : PS در THF به کمک همزن مغناطیسی به مدت ۱-۲ ساعت بدست می آید. غلظت PS و PSMA در محلول از ۹ تا ۲۳٪ و ۵ تا ٪۹ وزنی تغییر می کند که به محدوده اندازه فیبرها بستگی دارد . شمایی از روند عملیات ریسندگی الکترونی در شکل ۲ نشان داده شده است. محلول پلیمری وارد پمپ تزریق پلاستیک با حجم ۳ میلی لیتر شده و با سرعت ۰/۱۵ml/hr از یک سوزن ۳۰ درجه ای از جنسی استن استیل تزریق می شود. در مسیر خارج شدن محلول از سوزن اختلاف ولتاژی برابر ۷ کیلو ولت باعث بافته شدن فیبرها می شود. فیبر های بافته شده در روی ورقه آلومینیومی تمیز در فاصله ۷-۱۰cm از نوک سوزن جمع آوری می شوند. ۳. تثبیت آنزیم یا پوشاندن نانو فیبر: PS+PSMA در 1mgr از محیطی شامل mM ۱۰ بافر فسفات و کشت داده می شود. خوراک بدست آمده با سرعت ۲۰۰ دور بر دقیقه در دمای اتاق و به مدت ۳۰ دقیقه تکان داده شده و سپس با سرعت ۳۰ دور بر دقیقه به درون یک یخچال منتقل می شود. بعد از ۹۰ دقیقه قرار گرفتن درc ۴. محلول GA به آن اضافه می شود تا غلظت نهایی برای GA به ۰۵/ ۰ (W/V) برسد. مخلوط بدست آمده با سرعت ۳۰ دور بر دقیقه هم زده می شود. نانو فیبر پوشیده شده از مجموعه های آنزیمی به یک ظرف خوراک جدید منتقل شده و با 100 mm بافر فسفات و 100 mM و Tris-HCIشسته می شود. بعد از پوشش دادن . نانو فیبر مجدداً با 10mM از بافر فسفات به خوبی شسته می شود تا هیچ آنزیم تثبیت نشده ای در محلول مشاهده نشود. نانو فیبر تهیه شده در 10mM بافر فسفات (۷/۸ =PH) در دمای ۴°C نگهداری و انبار می شود. دو نمونه متفاوت دیگر از نانو فیبر پوشش داده شده نیز برای مقایسه, به همین روش اما با تفاوتهای زیر تهیه میگردد. اولین نمونه از اتصال کووالانسی CT با نانو فيبر بدون وارد GA بدست می آید و نمونه دوم از جذب ساده CT به نانو فیبر بدون ایجاد پیوند کووالانسی و استفاده از نانو فیبر PS بجای نانو PS+PSMA تهیه میشود .
۴. اندازه گیری فعالیت و پایداری:
فعالیت نانو فیبر پوشیده شده از آنزیم های CT (نانو فیبر بیو کاتالیستی) توسط هیدرولیز IP درون محلول آبی از بافر فسفات سدیم (PH=7.8,10mM ) اندازه گیری می شود. روش کار به این صورت است که نانو فیبرهای بیوکاتالیستی به درون یک ظرف شیشه ای کوچک منتقل شده و 4/04ml از بافر فسفات و به این مخلوط شروع واکنش آنزیمی اضافه می گردد. بعد از این مرحله ظرف شیشه ای با سرعت ۲۰۰ دور بر دقیقه تکان داده شده و مقدار محصول تولید شده (-P mitroaniline) از واکنش آنزیمی در هر مقطع زمانی توسط اندازه گیری میزان جذب، در A۴۱۰) ۴۱۰nm ) محاسبه می شود و در نهایت به کمک شیب منحنی A۴۱۰ بر حسب زمان میزان فعالیت بدست می آید. پایداری نانو فیبر بیو کاتالیستی نیز در بافر آبی 10mM بافر فسفات 7.8=PH تحت عملیات تکان دادن (۲۰۰ دور بر دقیقه) اندازه گیری می گردد. بعد از هر اندازه گیری . ظرف نمونه با mM ۱۰ بافر فسفات در سه مرحله شستشو داده می شود. این کار برای حذف مقادیر محصول و ماده اولیه باقی مانده است. فعالیت نسبی نیز از نسبت فعالیت باقی مانده و فعالیت اولیه محاسبه می شود.
نتایج و توضیحات
۱. شرایط فیزیکی برای ریسندگی نانو فیبرهای پليمر ی:
برای تولید نانوفیبر های ,PS PS+PSMA. از THF به خاطر فشار بخار بالا و فراریت زیاد به عنوان حلال سنتز کننده استفاده می شود افزایش غلظت پلیمر در حلال و افزایش ویسکوزیته محلول پلیمری دلیل بدست آمدن قطر ضخیم تری از فیبر است. در مسیر تولید دو محدوده ضخامت برای فیبر ها بدست می آید. یکی کمتر از m بالا ۱ و دیگری بزرگتر از Alm 1، جزئیاتتوزیع اندازه ها با آنالیز آماری تصاویر بدست آمده توسط میکروسکوپ SEM از فیبرها قابل ارزیابی است (شکل ۳). نازک ترین آنها دارای قطری حدود nm ۴۴۴ و ضخیم ترین آنها حدود AIml ۳/۰۴ می باشند. که به مورد اولی نانو فیبر و دومی میکرو فیبر گفته می شود. نانو فیبرها مناسب ترین مورد برای مطالعه تثبیت آنزیمی می باشند.
در بررسی توزیع اندازه که آنالیز SEM انجام شده است ہمی توان به موارد زیر اشاره کرد: اولاً : نانو فیبرها در بعضی مواقع از مهره ها و ذرات تنها شکل می گیرند که در این حالت. فرآیند با حداقل شدن مهره های شکل گرفته بر روی نانو فیبر تعدیل می شود. نمونه های استفاده شده برای تثبیت آنزیمی دارای مهره آزاد بزرگتری هستند. دوماً : دقت بالای تصاویر SEM , نشان می دهد که سطح فیبرها دارای حفره های کوچکی در حدود ۰-۴۰۰nm ۱۰ است (شکل 3a و 3b). شکل حفره ها در سطح نانو فیبر
