بخشی از مقاله
اصول و کاربردهاي بتا گالاکتوزيداز تثبيت شده در صنعت غذايي
چکيده
بتاگالاکتوزيداز، آنزيم صنعتي مهمي در هيدروليز شير و لاکتوز آب پنير ميباشد. هيدروليز آنزيمي لاکتوز از مشکلات سلامتي و محيطي حاصل از اين دي ساکاريد جلوگيري ميکند. به علاوه ، اين آنزيم تشکيل گالاکتو ـ اليگوساکاريدها را که براي غذاهاي به اصطلاح سالم ، افزودنيهاي پيش زيستي (پري بيوتيک ) هستند، کاتاليز ميکند. بتا گالاکتوزيداز، يکي از آنزيمهاي نسبتا معدودي است که در فرآيندهاي با مقياس بزرگ هم به طور آزاد و هم تثبيت شده مورد استفاده قرار ميگيرد. اين مقاله مروري بر تکنيک هاي اخير در تثبيت بتاگالاکتوزيد و کاربرد آن در صنعت غذايي ارائه ميدهد.
کلمات کليدي
تثبيت ، بتاگالاکتوزيداز، هيدروليز لاکتوز، گالاکتو ـ اليگوساکاريد، واکنشگرهاي زيستي
١. مقدمه
يکي از کاربردهاي مهم آنزيمها در صنعت ، آماده سازي لاکتوز هيدروليز شدة شير و آب پنير با استفاده از بتاگالاکتوزيداز ميباشد (٣.٢.١.٢٣ EC). اين آنزيم به وفور در طبيعت يافت ميشود و از حيوانات ، گياهان و ميکروارگانيسمها به دست آمده است . اين آنزيم ميکروبي در مقايسه با منابع حيواني و گياهي به ميزانهاي بيشتري توليد ميشود و از نظر تکنولوژيکي مهمتر است . آنزيم - هاي مهم صنعتي، عمدتا از مخمر کلاورومايسس لاکتيس ، فراجيليس ، مارکسيانوس ، کانديدا کفير و قارچ آسپرژيلوس نايجر يا اوريزا جدا شدهاند (هولسينگر و کليگرمن ١٩٩١) .
پارامترهاي اين آنزيم و قيمت آن ، ويژگيهاي اصلي هستند که تکنولوژي و هزينههاي مربوط به فرآيند هيدروليز لاکتوز را مشخص ميکنند. قيمت بتا گالاکتوزيداز نسبتا بالا است . در مقايسه با ارزش هزينه پايين ضايعات آب پنير، افزودن مستقيم بتا گالاکتوزيداز به اين زيرمجموعه ، از نظر اقتصادي قابل قبول نيست (ماهوني ١٩٩٧) . بايد از طريق ثابت سازي يا به کار بردن انواع مختلفي از تکنيکها و چهارچوبها بر اين مشکل غلبه کرد. کاتاليزورهاي حياتي تثبيت شده را ميتوان چندين بار استفاده کرد که اين عمل ، هزينههاي فرآيند را کاهش ميدهد (گناري و سايرين ٢٠٠٣). به علاوه ، کاربرد آنزيم تثبيت شده در مقايسه با آنزيم آزاد چندين مزيت دارد: مثل جداسازي سريع از محلول واکنش ، عدم آلودگي محصول توسط آنزيم (که اين موضوع به ويژه در تکنولوژيهاي غذايي مفيد است )، ثبات عملياتي و طولاني مدت ، پردازش (فراورش ) مداوم ، سيستمهاي واکنشي چند آنزيمي (در واکس و وب ١٩٩١) .
طي سه دهۀ اخير، کاربرد بتا گالاکتوزيداز در هيدروليز لاکتوز در فرآيند لبنياتي بسيار مورد توجه قرار گرفته است . اگرچه اکثر صنايع هنوز لاکتوز را با آنزيم آزاد هيدروليز ميکنند، ولي تثبيت بتاگالاکتوزيداز موضوعي است که به ويژه در پردازش (فراورش ) آب پنير بسيار مورد توجه قرار گرفته است (ژرمن ١٩٩٧) .
امروزه بتاگالاکتوزيداز تثبيت شده در کنار ساير آنزيمها در فرآيندهاي با مقياس وسيع مورد استفاده قرار ميگيرد (جدول ١).
اصول تثبيت بتاگالاکتوزيداز و مزاياي اين تکنولوژي در فرآيند هيدروليز لاکتوز و توليد گالاکتو اوليگوساکاريد در اين مقاله مورد بررسي قرار ميگيرند.
٢. هيدروليز آنزيمي لاکتوز
هيدروليز لاکتوز، هم با عمليات اسيد در دماي بالاتر (c١٥٠) و هم با کاتاليز آنزيمي توسط آنزيم بتا گالاکتوزيداز انجام ميشود که شرايط عملياتي سبک تري را براي هم براي دما و هم براي pH فراهم ميکند (گيکاس و لوپز ـ ليوا ١٩٨٥) . هيدروليز آنزيمي لاکتوز مزايايي به ويژه در سه زمينه دارد: بهداشت ، فن آوري غذايي و محيط .
بهداشت : معروف است که مصرف شير و ساير محصولات لبني براي اکثر جمعيت جوان دنيا محدود است (٧٥%) . اين افراد به دليل فقدان بتاگالاکتوزيداز در مخاط رودة کوچک قادر به هضم لاکتوز موجود در اين محصولات نيستند. مصرف مواد لبني در اين افراد سبب دردهاي ناحيۀ شکمي، اسهال ، دل درد يا نفخ ميشود. اگر لاکتوز در اين محصولات توسط بتاگالاکتوزيداز به قندهاي آماده مصرف ، گلوکز و گالاکتوز هيدروليز شود، ميتوان جلوي اين مشکل را گرفت (سيبد و سايرين ١٩٩٧) . مزيت ديگر هيدروليز آنزيمي لاکتوز، تشکيل همزمان گالاکتواليگو ساکاريد (GOS) است که به عنوان اجزاي غذايي پيش زيستي مورد استفاده قرار ميگيرند. اين ترکيبات غيرقابل هضم هستند و به عنوان فيبر غذايي عمل ميکنند. اين ترکيبات رشد بيفيدوباکتري رودهاي را با اثر بهداشتي بعدي در روده و کبد افزايش ميدهند.
اين روزها تقاضا براي محصولات GOS و ارتقاء توليد GOS مؤثر و ارزان به طور چشمگيري افزايش داشته است . (توهي و سايرين ٢٠٠٣) .
فن آوري غذايي : محتواي بالاي لاکتوز در محصولات لبني مثل بستني، شيرهاي يخ زده و شير تغليظ شده ميتوان سبب تبلور بيش از حد لاکتوز شود که منجر به توليد محصولاتي بافت آردي، شن مانند يا خشک ميشود. استفاده از بتاگالاکتوزيداز براي توليد چنين محصولاتي ميتواند غلظت لاکتوز را به ميزان قابل قبول کاهش دهد و بنابراين برخي از ويژگيهاي تکنولوژيکي و حسي محصولات لبني را افزايش ميدهد مثل : افزايش قابليت هضم ، نرمي و خامه مانند بودن و غيره (زادو ١٩٩٣) .
محيط : در صنعت پنيرسازي ، لاکتوز به عنوان ضايعات محسوب ميشود که سبب مشکلات اقتصادي و محيطي ميشود. تقريبا ٤٧ درصد از آب پنير توليد شدة سالانه در سراسر جهان دور ريخته ميشود . اين مشکل به اين دليل رخ ميدهد که لاکتوز مربوط است به نياز به اکسيژن شيميايي و زيست شيميايي بالا و قابليت حل غيرقطعي لاکتوز (گوماراس و سايرين ١٩٩٢). هيدروليز لاکتوز موجود در آب پنير، آب پنير را به شربتي شيرين و بسيار مفيد تبديل ميکند که ميتواند در صنايع لبنياتي، شيريني پزي، نانوايي و نوشيدنيهاي غيرالکلي مورد استفاده قرار گيرد (پيوارنيک و سايرين ١٩٩٥) . به علاوه ، چندين بررسي فرصت تجزيۀ لاکتوز آب پنير را با استفاده از بتاگالاکتوزيداز براي توليد گالاکتواليگوساکاريد، نشان دادند. (فودا و لوپز ـ ليوا ٢٠٠٠ ؛ نووالين و سايرين ٢٠٠٥) .
٣. تثبيت بتاگالاکتوزيداز
آنزيم ثابت را به عنوان "آنزيم اساسا محدود يا محدود شده در ناحيهاي خاص با حفظ فعاليت کاتاليزياش تعريف ميکنند که مي - تواند به طور مکرر و مداوم مورد استفاده قرار ميگيرد" (شيباتا ، ١٩٧٨) . بتاگالاکتوزيداز يکي از مهمترين آنزيمهاي مورد مطالعه بدليل ثابت سازي آن است . اگرچه بسياري از مطالعاتي به توصيف تثبيت موثر بتاگالاکتوزيداز جدا شده از اشرشياکلي نوترکيب ميپردازد ولي کاربرد آن در صنعت غذايي پيچيده است زيرا اين ميکرو ارگانيسم کلا ايمن تشخيص داده نشده است (GRAS) (لادرو و سايرين ٢٠٠١ ؛ دي سريو و سايرين ٢٠٠٣) . در حال حاضر وضعيت GRAS براي آسپرژيلوس نايجر، اوريزا، لاکتيس و فراجيليس که توليدکنندگان مهم بتا گالاکتوزيداز مورد استفاده در صنعت غذايي هستند، معتبر است . انتخاب آماده سازي آنزيمي مناسب به خواص آن و هدف از کاربردش بستگي دارد. بتا گالاکتوزيدازهاي مخمر معمولا براي هيدروليز لاکتوز در شير مورد استفاده قرار ميگيرند و آب پنير شيرين ميتواند خواص بتاگالاکتوزيدازها شامل ثبات اين آنزيم در pH يا دماهاي بالا يا پايين را ارتقا دهد. بنابراين در قالب جلوگيري از رشد ميکروبي در اين واکنشگر، اين شکلهاي آنزيمي براي فرآيندهاي هيدروليز لاکتوز مفيدترند (ژو و چن b ٢٠٠١ ؛ تانرسيون و دوگان ٢٠٠٢) به علاوه فن آوري ثابت سازي، نشان دهندة نقش مورد انتظار در کاهش مهار محصول است . همان نقشي که سبب تبديل بيشتر هيدروليز لاکتوز ميشود (جورادو و سايرين ٢٠٠٢ ؛ پسلا و سايرين ٢٠٠٣) .
٤. تکنيکها و قالبهايي براي تثبيت بتاگالاکتوزيداز
بتاگالاکتوزيدازها به چندين روش به انواعي از قالبها، ثابت سازي شدهاند شامل : به دام اندازي، اتصال ضربدري، جذب سطحي، ارتباط هم ظرفيتي يا ترکيبي از اين روشها (جدول ٢) . از آنجا که هر روش مزايا و مشکلات خاص خودش را دارد، انتخاب روش ثابت سازي مناسب بستگي دارد به آنزيم (خواص مختلف انواع بتاگالاکتوزيدازها مثل وزن مولکولي، طول زنجيرة پروتئين و وضعيت اين محل فعال )، قالب ، شرايط واکنش ، واکنشگر و غيره (تاناکا و کاواماتو ١٩٩٩) .
١.٤. ترکيب کووالانسي (ارتباط هم ظرفيتي)
اين روش پرکاربردترين روش براي ثابت سازي بتاگالاکتوزيداز است (جدول ٢). در اين روش آنزيمهاي هم ظرفيت از طريق گروه - هاي فعال در اين آنزيمها به هم متصل ميشوند که براي فعاليت کاتاليزي ضروري نيستند. اين روش در مقايسه با ساير روشها مزاياي زير را دارد: اين آنزيمها از حامل ، نشت نميکنند و جدا نميشوند، از آنجا که اين زيست کاتاليست در روي سطح حامل قرار دارد، ميتواند به آساني با اين زيرمجموعه رابطه برقرار کند. از طرف ديگر، نواقص عمدة اين روش ، هزينههاي بالا و بازده توليدي کم ميباشد به دليل در معرض بودن زيست کاتاليست در برابر شناساگرهاي سمي يا شرايط سخت واکنشي (تاناکا و کاواموتو ١٩٩٩) . براي ثابت سازي بتاگالاکتوزيداز چندين قالب مورد استفاده قرار گرفتهاند. مواد اکسيدي مثل آلومينا، سيليکا، آلومينا سيليکات براي ترکيب کووالانسي بتاگالاکتوزيداز از K. marxianus مورد استفاده قرار گرفتهاند و در فرآيندهاي هيدروليز لاکتوز به کار گرفته شدند. علي رغم اينکه ثابت سازي دوام خوبي نشان داد، بازدههاي ثابت سازي کمتر از ٥ درصد بودند (دي سديد و سايرين ٢٠٠٣). بتاگالاکتوزيداز حاصل از K. fragilis به صورت کووالانسي از طريق گروههاي آمينو با استفاده از گلوتارالدئيد به طور کووالانسي به مهرههاي شيشهاي متخلخل متصل شد. کارآيي جفت شدن بسيار بالا بود زيرا بيش از ٩٠ درصد اين آنزيم فعال بود ٨٧.٥ درصد اين پروتئين براي پشتيباني متصل شد. از آنجا که از گرافيت مرغوبي براي ثابت سازي بتاگالاکتوزيداز استفاده شد ، ثابت سازي اين آنزيم بر روي تخته سنگهاي گرافيت به وسيلۀ واکنش بين گروههاي فعال گرافيت و مولکولهاي اين آنزيم براي تشکيل رابطۀ کووالانسي با استفاده از گلوتارالدئيد به عنوان يک معرف . شناساگر اتصال عرضي انجام شد. ثابت سازي ، ثبات حرارتي آنزيم را افزايش داد و pH مطلوب را به ارزش (ميزان ) قلياييتر افزايش داد (٧٠٧) در مقايسه با آنزيم آزاد (٦٠٦) (ژو و چن a٢٠٠١) . قارچ بتاگالاکتوزيداز به طور کووالانسي با گلوتاروال دهايد ترکيب شد تا به لحاظ شيميايي بلغورهاي ذرت را اصلاح کند. اگرچ مادة ثابت سازي ويژگيهاي بسياري دارد مثل : ارزان بودن ، ثبات بالا، ويژگي - هاي مکانيکي مناسب ولي ميزان ثابت سازي بسيار پايين بود (٨%) (سيسو و سايرين ١٩٩٤) . از بين قالبهاي فيبري مختلف آزمايش شده (مادة پلي استر بافته نشده ، پنبۀ هيدروفيل ، پارچۀ حولهاي، پارچه ريون بافته نشده )، بتا گالاکتوزيداز (از آسپرژيلوس اوريزا) به طور کووالانسي به پارچۀ کتاني فعال شده با کلريد توسيل ترکيب شد و با کارآمدي جفت شدگي ٨٥% و ميزان فعاليت آنزيم ٥٥ درصد، بيشترين فعاليت آنزيمي ثابت شده را نشان داد. ثبات حرارتي اين آنزيم با ٢٥ لايه بر ثابت سازي افزايش يافت و اين آنزيم ثابت شده نيمه عمر ٥٠ روزه در ٥٠ درجه سانتي گراد داشت . چيزي بيش از يک سال در دماي ٤٠ درجه سانتي گراد (البليراک و يانگ c٢٠٠٢) . گياکوميني و سايرين ١٩٩٨، خواص بتاگالاکتوزيداز کي . لاکتيس ثابت شده را با استفاده از ٢ حامل دوتايي مختلف مقايسه کرد: ژل گلوتارال دهايد ـ آگارز و ژل تيوسالفينات ـ آگارز . گلوتارالدئيدآگارز، پس از ثابت سازي نسبت به تيوسالفينات ـ آگارز، بازدهي کمتري نشان داد (٤٠-٣٦ درصد) بازدهي تيوسالفينات ـ آگارز (٨٥-٦٠%) اما خواص حرارتي بهتري داشت .
٢.٤. به دام اندازي
اين روش براساس تعيين محل يک آنزيم در غشاي شبکه است . به دام اندازي، بيشتر براي ثابت سازي سلولهاي نه آنزيمها توسعه يافته و مورد استفاده قرار گرفته است . محدوديت عمدة اين تکنيک براي ثابت سازي آنزيمها، نشت احتمالي در طي کاربرد مکرر به دليل اندازة مولکولي کوچک در مقايسه با سلولها است . عيب ديگر اين روش ، محدوديتهاي انتشار هستند. روش به دام اندازي به پنج نوع مهم طبقهبندي شده است : شبکه ، ميکروکپسول ، ليپوزوم ، غشاء مسيل برعکس (تاناکا و کاواموتو ١٩٩٩). براي ثابت سازي بتاگالاکتوزيداز، روش لايتس (شبکه ) بيشترين کاربرد را دارد. آنزيم در چارچوب پلي مرهاي مختلف طبيعي يا مصنوعي به دام ميافتد. آلجينت ، يک پلي ساکاريد با رخداد طبيعي که با انعقاد يونوتروپيک ، ژل را تشکيل ميدهد، رايج ترين است . مامارلا و رابيولد در سال (٢٠٠٥) بتاگالاکتوزيداز کي . فراجيليس را در ژلهاي آلمبينت ـ کاراگينان به دام انداختند تا دانهها شکل دهند. وجود کي ـ کاراگينان اثر مطلوبي بر واکنش آنزيمي داشت زيرا اين ژل با يونهاي مثبت +k شکل گرفت که فعاليت آنزيم را افزايش دادند. آلجينات هم به عنوان يک قالب ثابت سازي در ترکيب با ژلاتين با بتاگالاکتوزيداز حاصل از آسپرژيلوس اريزا در فيبرها مورد استفاده قرار گرفت . آنزيم ثابت شده ثبات عملياتي خوبي نشان داد ( ٣٥ روز بدون کاهش فعاليت ) . به علاوه در دماي ٧٠ درجه آنزيم ثابت شده ٢٧ درصد از فعاليت اوليۀ خود را حفظ کرد (آنزيم آزاد تمام فعاليت خود را از دست داد) و در pH ٩ ، آنزيم ثابت شده ٢٥ درصد از فعاليت اوليه را داشت . (آنزيم آزاد فقط ١١.٥% را حفظ کرد) (تانريسون و دوگان ٢٠٠٢). از بين پليمرهاي مصنوعي به کار رفته براي به دام انداختن بتاگالاکتوزيداز، ژل پلي وينيل الکل بسيار جذاب بود زيرا به دليل شرايط مناسب تهيهاش ، ثبات و دوام ، قابليت زيستي، قدرت ساختاري و خواص پراکندگياش (رسي و سايرين .(1999
نوع ميکروکپسول ، شامل به دام اندازي در يک پليمر نيم نفوذپذير است . تهيۀ ميکروکپسولهاي آنزيم به شدت به شرايط کنترل شدة مناسب نياز دارد. تاکيدين و آميجي در سال ٢٠٠٤ روش تلفيق دادههاي جديدي طراحي کردند که در آن ميکروکپسولهاي آلجينت ـ چيتوزان پوسته ـ هسته براي ثابت کردن بتاگالاکتوزيداز شکل گرفتند. اين آنزيم در هستۀ داخلي آلجينت تجزيه پذير زيستي قرار گرفت و مورد حمايت واقع شد در حالي که پوستۀ خارجي چيتوزان خواص انتقالي نشان دادند. در هنگام استفاده از يونهاي +Ca٢ براي اتصال عرضي آلفيبت ، استفاده از کپسولهايي با هستۀ مايع توليد شدند با سودمندي بارگيري ٦٠ درصدي در هنگام استفاده از يونهاي +Ba٢ ، ميکروکپسولهايي با هستۀ جامد توليد شدند و سودمندي بارگيري ١٠٠ درصدي حاصل شد.
نوع ليپوزوم ، در يک غشاي آمفيپاتيک مواد فعال در سطح مايع تهيه شده از ليپيد، به دام افتاد (معمولا فسفوليپيدها) (کربي و گرگورياديس ١٩٨٤) .
در نوع مسيل برعکس ، بتاگالاکتوزيداز در مسيلهاي وارونه به دام ميافتد که با ترکيب يک سطح با يک محلول آلي تشکيل مي - شوند مثلا مسيلهاي وارونۀ ايزوکتان و در اين نوع غشا، اين آنزيم با يک غشاي فوق تصفيه ، يک غشاي ريز تصفيه يا يک فيبر توخالي از محلول واکنش جدا ميشود. (چاکچاي ما واسدي و سايرين ٢٠٠٥) .
٣.٤. جذب سطحي فيزيکي
ش
