بخشی از مقاله
چکیده
این مطالعه با هدف بررسی تنوع ژنتیکی بالقوه در ژن بتا کازین مرتبط با صفاتی تولیدي شیر در بزهاي شیري خلخالی انجام گرفت.
براي انجام این مطالعه از روش PCR-SSCP جهت شناسایی الگوهاي مختلف و توالی یابی آن استفاده شد. نتایج این مطالعه منجر به شناسایی 2 الگوي مختلف گردید که با بررسی توالی یابی هاي حاصل منجر به شناسایی 2 جهش شد که باعث ایجاد 2 هاپلوتیپ با فراوانی به ترتیب 0/6 و 0/4 گردید. توالی یاب هاي الگوي مختلف منجر به شناسایی یک حذف و اضافه شدن نوکلئوتید A و یک جایگزینی بین نوکلئوتیدهاي G و T از نوع جهش ترانسورژن گردید که ژنوتیپ هاي GG و GT با فراوانی 0/84 و 0/16 در جمعیت هاي مورد مطالعه مشاهده گردید و هیچ نوع ژنوتیپ TT در این جمعیت هاي مشاهده نشد.
.1 مقدمه
بزخلخالی یکی ازنژادهاي برتر تولید شیر در کشور می باشد، که در دهه اخیربخشی ازتحقیقات ژنتیک مولکولی در زمینه اصلاح نژادگله هاي شیرده را به خود اختصاص داده است. درمقطع کوتاهی مورد توجه پروژه هاي اصلاح نژادي قرارگرفته است. بزخلخالی داراي 60 کروموزم است. و با خصوصیات ظاهري اغلب سیاه رنگ در مواردي روشن وپوشش مویی بدن این بز بلند ضخیم و گوش پهن وکوتاه می باشد. پراکنش جغرافیایی در دشت مغان و اطراف شهرستان خلخال و بخش هاي از استان آذربایجان شرقی می باشد.
پروتئین هاي شیر به دو گروه عمده ي کازئین و پروتئین هاي محلول در سرم شیر طبقه بندي می شوند که هر یک نیز به نوبه ي خود متشکل از گروه هاي کوچکتري هستند. تاکنون هیچ گونه اي که پروتئین هاي شیر آن شباهتی به یکی از گروههاي پروتئینی دیگرداشته باشد یافت نشده است . لازم به ذکر است که در برخی از گروه هاي پروتئینی شیر گونه هاي مختلف تفاوت فاحشی وجود دارد. بیشتر از 95 درصد پروتئین شیر در نشخوارکنندگان بوسیله 6 ترکیب ژن ساخته می شود. که از 4 نوع کازیین و دو پروتئین آب پنیر شامل آلفا لاکتوگلوبولین و بتا لاکتوگلوبولین تشکیل شده است.
کازئین ها گروه خاصی از پروتئین هاي شیر با مشخصاتی، مانند باندهاي استري فسفات، مقادیر بالاي پرولین، سیستئین پائین یا فقدان آن و حلالیت کم در Ph برابر با 0/4-0/5 را دارند
ژن هاي کازیین از جمله ژن هاي کاندیدایی می باشند که براي بهبود خصوصیات شیر تولیدي در دام هاي شیرده بکار گرفته می شود، که دردهه اخیر زمینه بسیاري ازتحقیقات ژنتیک مولکولی درزمینه هاي اصلاح نژاد گله هاي شیرده رابه خود اختصاص داده است
کازیین ها نه تنها تامین کننده کلسیم فسفات و اسیدآمینه هستند بلکه دراصلاح نژاد حیوانات نشخوارکننده نیز موثر می باشد چون برروي صفات تولیدي شیر و ساخت خصوصیات پنیر نیز تاثیر دارد - وین سنت، - .2014
ژن کازئین داراي پیوستگی بالا در کروموزوم6 است و براي بهبود کیفیت شیر در مقایسه با سایر ژنها ارجحیت دارد و در انتخاب حیوانات مورد استفاده قرار می گیرد
چند شکلی موجود در ژن csn2 ازجمله ژن کاندیدایی می باشد که براي بهبود خصوصیات تولیدشیر در دام هاي شیرده استفاده می شود. از لحاظ جایگاه کروزومی دربز، روي کروموزوم شماره 6 قرار دارد و نقش کلیدي در خصوصییات تولیدي شیر وتولید پنیر دارند. داراي 9 اگزون و 18 اینترون می باشد - شانکوا و همکاران، . - 2008 ترتیب و جهت دسته زیاد ژنها درسیگنال پپتیدي و بیشتر مرحله فسفریلاسیون بطور عمده درقسمت UTR ’3 ,’5انجام می گیرد. و در همه کازئین ها اولین اگزون در ناحیه UTR ’5 رمزگذاري می شود - مارلتا و همکاران، . - 2007 با توجه به اهمیت شیر و نقش آن در سلامت و اقتصاد جامعه این مطالعه با هدف بررسی و شناسایی بخش هاي از ژن هاي بتا کازئین در جمعیت بزهاي خلخالی انجام گرفت.
.2 مواد روش
تهیه نمونه از جمعیت هاي بز هاي خلخالی
جهت اجراي این پروژه از گله هاي بز در شهرستان خلخال استفاده شد و از بین بزها این شهرستان به تعداد 100 رأس بز خلخالی نمونه گیري به عمل آمد. از رگ وداج گردنی با استفاده از ونوجکت حاوي EDTA جهت خونگیري و تهیه نمونه خونی استفاده شد. سپس جهت استخراج DNA در بسته بندي هاي حاوي یخ به آزمایشگاه ژنتیکی در دانشگاه محقق اردبیلی انتقال یافت.نمونه هاي بدست آمده در آزمایش ژنتیک دانشگاه تا زمان انجام مراحل استخراج DNA در فریز منفی بیست درجه سانتی گراد نگهداري شدند. در این تحقیق جهت استخراج DNA از روش کیت.... استفاده شده است.
از تمامی حیوانات جهت بررسی اثر ژن هاي مورد بررسی نمونه هاي شیر تهیه شد و بلافاصله بعد از انتقال به آزمایشگاه با استفاده از دستگاه میلکو اسکن اجزاي ترکیبات شیر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
تکثیر جایگاه ژن بتا کازئین
با استفاده از یک جفت پرایمر اختصاصی CSN2تکثیر شد
رفتَ:CAGAATTGACTGGGACTGGA-3َ-5
برگشتَ:TGCCTAAGGGTTAATTTATTGAAA-3َ-5
برنامه حرارتی براي تکثیر ژن بتاکازئین باتکنیک PCR به ترتیب عبارت از دماي واسرشت شدن اولیه 94 درجه به مدت
5 دقیقه و 35 چرخه به ترتیب واسرشت سازي 94 درجه به مدت 1 دقیقه، اتصال پرایمرها 56 درجه به مدت 60 ثانیه و بسط 72 درجه به مدت 60 ثانیه و در نهایت بسط نهایی 72 درجه به مدت 7 دقیقه انجام گردید .
غلظت هاي مورد استفاده از مواد بعد از بهینه سازي براي تکثیر جایگاه ژن الفاکازئین و بتا کازئین براي انجام PCR به ترتیب 2/5 میکرولیتر DNAژنومی،3 میکرولتر از پرایمر،12/5میکرولیتر ازMIX MASTER، مابقی را تا رسیدن به حجمμL 25 از آب مقطر استفاده شد.
محصولات تکثیر شده با استفاده از روش SSCP تعیین الگو شده سپس با استفاده از روش توالی یابی سنگر توالی یابی شدن ودر نهایت چند شکلی هاي موجود در این ژن با بکار بردن نرم افزارهاي MEGA6 و DNAsp شناسایی گردیدند
نتایج و بحث
استفاده از ژنهاي کاندیدا بعنوان ابزار انتخاب در اصلاح دام منجر به بهبود سریع دامها در صفات عملکردي می شود این تکنیک در دامهایی که اطلاعات شجره اي و فنوتیپی مناسبی ثبت نشده است از اهمیت دوچندانی برخوردار است. تنوع ژنتیکی بدست آمده ممکن است بطور مستقیم و یا غیر مستقیم بر روي صفات مهم تولیدي موثر باشد. توالی هاي تکثیر شده ژن بتاکازئین با استفاده از روش SSCP تعیین ژنوتیپ شد که منجر به شناسایی دو الگوي متفاوت گردید همه باندها براساس تفاوت در تعداد و الگوي باند هاي موجود نام گذاري کردند.
با بررسی توالی یابی هاي حاصل منجر به شناسایی 2 جهش شد که باعث ایجاد 2 هاپلوتیپ با فراوانی به ترتیب 0/6 و 0/4 گردید. توالی یابی هاي الگوي مختلف منجر به شناسایی یک حذف و اضافه شدن نوکلئوتید A - شکل - 1 و یک جایگزینی بین نوکلئوتیدهاي G و T از نوع جهش ترانسورژن گردید - شکل - 2 که ژنوتیپ هاي GG و GT با فراوانی 0/84 و 0/16 در جمعیت هاي مورد مطالعه مشاهده گردید و هیچ نوع ژنوتیپ TT در این جمعیت هاي مشاهده نشد.
