بخشی از مقاله
چکیده
سرطانها در اثر رشد کنترل نشده سلولهای غیرطبیعی شده بدن ایجاد میشوند. سلولهای سرطانی از طریق مکانیسمهای مختلفی از دسترس سیستم ایمنی بدن دور میمانند. مطالعات انجام شده در سالهای اخیر نشان داده تولید TGF- در بافتهای تومور افزایش مییابد و با سرکوب پاسخهای ایمنی ضد تومور در رشد تومورها نقش دارد. در تعدادی از مطالعات افزایش میزان TGF- در خون محیطی برخی از بیماران مبتلا به سرطان گزارش شده است و بین افزایش این عوامل در خون و پیشآگهی بد بیماری ارتباط داده شده است. در این مطالعه در موشهای Balb/c به صورت تجربی تومور پستان ایجاد شد و عصاره گزنه به صورت خوراکی به موشهای واجد تومور داده شد. کینتیک رشد تومور در موشهای گروه تیمار و موشهای گروه شاهد بررسی شد و میزان بیان TGF- در موش-های واجد تومور در مقایسه با موشهای شاهد تومور با روش Real time RT-PCR ارزیابی شد. نتایج نشان داد گزنه بر روی بیان ژن TGF- به میزان زیادی اثر ممانعتی دارد. تجویز خوراکی عصاره گزنه همزمان با تلقیح تومور باعث کاهش رشد تومور شد ولی این کاهش معنیدار نبود . - P 0/05 - این یافتهها نشان میدهد عصاره گزنه میتواند بر پاسخهای ایمنی ضد تومور در مدل سرطان پستان تأثیر مثبت داشته باشد ولی برای درمان تومور باید از درمانهای ترکیبی استفاده نمود.
واژه های کلیدی : سرطان، تومور، ایمنی، TGF-
مقدمه
سرطان رشد کنترل نشده سلولهای غیرطبیعی در بدن میباشد و یک بیماری مهلک با آمار مرگ و میر بالاست که درگیریهای روانی و اقتصادی زیادی را بدنبال دارد. اگرچه سرطان میتواند تقریبا در هر بافتی از بدن توسعه یابد، اما هر نوع سرطان دارای ویژگیهای منحصر بفردی است. فرآیندهای اساسی که برای ایجاد سرطان لازم است، در تمام اشکال آن مشابه است. این رشد غیرطبیعی معمولا، اما نه همیشه یک توده را تشکیل میدهد. درمان و پیشگیری از سرطان یک چالش بزرگ در جوامع بشری در سراسر دنیا به شمار میرود. سرطان سینه یکی از شایعترین بدخیمیهای نئوپلاستیک زنان در جهان میباشد و مهمترین دلیل مرگ ناشی از سرطان در خانمها را به خود اختصاص داده است . میزان شیوع آن در کشورهای دنیا متفاوت گزارش شده و روز به روز در حال افزایش است.
تحقیقات نشان میدهد که شیب افزایش شیوع سرطان سینه در کشورهای در حال توسعه بیشتر بوده و متوسط عمر بیماران مبتلا در این کشورها کمتر میباشد.طی مطالعات صورت گرفته مشخص گردیده که میزان شیوع سرطان سینه در کشور ایران رو به افزایش است و این بدخیمی همچنان به عنوان شایعترین سرطان در زنان ایرانی مطرح بوده و اطلاعات موجود، از افزایش شیوع این بدخیمی طی دو دهه گذشته در ایران حکایت دارد. از جمله راهکارهای درمانی این بدخیمی میتوان به شیمیدرمانی، رادیوتراپی و جراحی اشاره کرد. با این وجود میزان مرگ و میر در افراد مبتلا که تحت درمان قرار میگیرند، بالا میباشد که خود حکایت از ناکارآمدی این راهکارهای درمانی دارد.
شناحت مکانیسمهای مهم و دخیل در ایجاد سرطان برای پیشبرد روشهای درمانی، جهت کنترل و درمان سرطان بسیار مهم میباشد. ژن TGF- تقریبا در تمام انواع سرطانهای اپیتلیالی از جمله سینه، پروستات، ریه، روده بزرگ، لوزالمعده و سرطان پوست مطالعه شده است. از طریق این مطالعات مشخص گردیده که TGF- می-تواند دارای نقش دوگانه به عنوان سرکوبگر تومور و پروموتور تومور داشته باشد. در سلولهای اپیتلیال خوشخیم و بسیاری از تومورها در مراحل اولیه TGF- القا کننده قوی در توقف رشد است. با این حال در تومورهای پیشرفته که مسیرهای سیگنالینگ به شدت نامنظم هستند، رشد و پیشرفت تومور را بدنبال دارد.
در تومورهای پیشرفته سطح TGF- در محیط تومور به طور مثبت با اندازه تومور، تهاجم و تمایز وابسته بوده و نشانگر پیشآگهی بیمار میباشد.تجویز داروهای گیاهی توسط بیماران و بدون مشاوره پزشک در سطح جهانی در حال افزایش است. داروهای گیاهی و عصارههای آنها شامل ترکیبی از مواد موثره هستند که یا به تنهایی دارای اثر درمانیاند و یا به شکل ترکیبی با سایر داروها به صورت سینرژیسم عمل کرده و شانس درمان را افزایش می-دهند.از گیاهان دارویی میتوان به گیاه گزنه اشاره کرد که دارای 40 جنس و حدود 500 گونه میباشد که اکثر آنها در آمریکا، هند، مالزی و نواحی حارهای میرویند. گزنه دارای تانن، موسیلاژ،نوعی ماده مومی، اسیدفورمیک، فیتوسترین، نیترات پتاسیم و کلسیم، ترکیبات آهن، نوعی گلیکوزید با اثر قرمز کننده پوست است. از سرشاخههای این گیاه، ماده رنگی اورتیسین بهدست می-آید. با توجه به مطالعات صورت گرفته بر روی گیاه گزنه و بررسی اثرات ضد سرطانی آن، در این مقاله به بررسی اثرات عصاره خوراکی گزنه بر روی فاکتور رشد دگرگون کننده بتا TGF- در سلول های توموری رده پستان گرفته شد.
روش کار
کشت سلولهای توموری و تلقیح تومور برای ایجاد سرطان پستان از سلولهای رده توموری پستان استفاده شد. سلولهای توموری پستان در محیط کشت RPMI1640 - اینویتروژن، بریتانیا - حاوی 10% سرم جنین گاو - Fetal bovine - serum/FBS - جیپکو-بریتانیا - ، -Lگلوتامین - 2mM - - سیگما، بریتانیا - و آنتیبیوتیکهای پنیسیلین - 100 U/ml - و استرپتومایسین - 100 J/PO - کشت داده شدند - تصویر . - 1 انکوباسیون سلولها در دمای 37œC و اتمسفر واجد CO2 5% و 95% رطوبت انجام شد. قبل از تلقیح تومور سلولها از نظر آلودگی به مایکوپلاسما توسط کشت میکروبی بررسی شدند. برای تلقیح تومور سلولها از فلاسک کشت سلول با تریپسینه کردن جدا شدند و پس از شستشو، به تعداد 5×105 به صورت زیر جلدی در تهیگاه موشها - موشهای همخون - BALB/c تزریق شدند . موشها در حیوانخانه ایزوله نگهداری داده شدند و دسترسی آزاد به آب و غذا داشتند. حیوانخانه دارای سیکل روشنایی-تاریکی 12 ساعت-12 ساعت و دمای جایگاه نگهداری موشها 22-26 درجه سانتیگراد بود. ده روز پس از تزریق سلولهای سرطانی، تومورها قابل مشاهده بودند. تومور قبلاً با هیستوپاتولوژی تأیید شده بود. این تومور از نوع بدخیم است و نکروز هم در مقاطع بافتی مشاهده میشود.
بررسی تأثیر تجویز خوراکی عصاره گزنه بر رشد تومور برای بررسی تأثیر عصاره گزنه بر رشد تومور پستان در سه مرحله آزمایش انجام گرفت. در مرحله اول سه گروه موش در نظر گرفته شدند. گروه اول شامل 5 سر موش شاهد سالم، گروه دوم شامل 5 سر موش شاهد توموری و گروه سوم شامل 5 سر موش تیمار بود. در گروه اول مداخلهای انجام نشد. در گروه دوم به موشها دو ماه بعد از شروع آزمایش سلولهای توموری تزریق شد. در گروه سوم، عصاره گزنه - 4% - به غذای موشها به مدت دو ماه اضافه شد و پس از آن سلولهای توموری به تهیگاه موشها تزریق شد. تا شش هفته میزان رشد تومور در موشهای گروه شاهد تومور و گروه تیمار با کمک کولیس دیجیتال اندازهگیری شد. برای اندازهگیری میزان رشد تومور، ابعاد تومورها با کولیس دیجیتال اندازهگیری شد و میزان رشد تومور در موشهای گروه تیمار با رشد تومور در موشهای گروه شاهد توموری مقایسه شد.
در مرحله دوم آزمایش، سه گروه موش در نظر گرفته شدند. گروه اول شامل 5 سر موش شاهد سالم، گروه دوم شامل 5 سر موش شاهد توموری و گروه سوم شامل 5 سر موش تیمار بود. در گروه اول مداخلهای انجام نشد. در گروه دوم به موشها دو ماه بعد از شروع آزمایش سلولهای توموری تزریق شد. در گروه سوم، عصاره گزنه به غذای موشها - 4% - به مدت 100 روز و به آب موشها - 4% - به مدت 70 روز اضافه شد. دو ماه پس از اضافه کردن عصاره گزنه به غذا و آب موشها، سلولهای توموری به تهیگاه موشها تزریق شد. تا 40 روز میزان رشد تومور در موشهای گروه شاهد تومور و گروه تیمار با کمک کولیس دیجیتال اندازهگیری شد.
در مرحله سوم آزمایش، سه گروه موش در نظر گرفته شدند. گروه اول شامل 5 سر موش شاهد سالم، گروه دوم شامل 5 سر موش شاهد توموری و گروه سوم شامل 5 سر موش تیمار بود. در گروه اول مداخلهای انجام نشد. در گروه دوم در زمان شروع آزمایش سلولهای توموری به موشها تزریق شد. در گروه سوم، عصاره گزنه به غذای موشها - 4% - و آب موشها - 4% - به مدت 40 روز اضافه شد و همزمان سلولهای توموری به تهیگاه موشها تزریق شد. تا 40 روز میزان رشد تومور در موشهای گروه شاهد تومور و گروه تیمار با کمک کولیس دیجیتال اندازهگیری شد.
دادهها با نرمافزار - SPSS Statistics version 22 - SPSS و با روش T test آنالیز شدند. p 0/05 معنیداری در نظر گرفته شد. بررسی تأثیر تجویز خوراکی عصاره گزنه بر بیان ژن TGF- در بافت تومور پستان برای بررسی تأثیر تجویز خوراکی عصاره گزنه بر بیان ژن TGF-در بافت تومور؛ از بافت تومور mRNA استخراج شد و پس از سنتز cDNA بیان ژن TGF- در مقایسه با ژن House keeping - HPRT - با تکنیک Real time PCR ارزیابی شد.
استخراج mRNAهای بافت تومور برای به دست آوردن mRNA های بافت تومور، سلولها با استفاده از بافر لیز کننده حاوی گوانیدین تیوسیانات - محلول کیازول، آمریکا - متلاشی شدند. پس از اضافه کردند بافر لیز کننده و انکوباسیون به مدت 5 در دمای25œC، کلروفرم - 0/2ml - اضافه شد و پس از ورتکس، میکروتیوبها به مدت 10 در دمای 25œC انکوبه شدند. با سانتریفیوژ میکروتیوبها - در دور 12000g به مدت 15 در دمای - 4œC سه فاز تشکیل شد. RNAاز فاز روییِ شفاف و بیرنگ با اضافه کردن ایزوپروپانل - 0/5ml - و سپس انکوباسیون به مدت 10 در 25œC و سانتریفیوژ - با دور 12000g به مدت 10 در دمای - 4œC رسوب داده شد. رسوب با اتانل - 1ml - 75% شستشو داده شد
و پس از سانتریفیوژ - در دور 7500g به مدت 5 در دمای - 4œC و خشک کردن رسوب؛ RNA در آب عاری از RNase حل شد. حذف بقایای DNA در RNAهای استخراج شده با استفاده از DNase I عاری از RNase و بافر Tris-HCl - 10mM - با PH=7/5 هرگونه DNA باقیمانده در RNA استخراج شده حذف گردید. کیفیت و مقدار RNA به دست آمده با استفاده از الکتروفورز در ژل آگارز و نانودراپ بررسی شد.
سنتز cDNA از mRNAهای استخراج شده از سلولهای توموری سنتز cDNA از روی mRNAهای استخراج شده توسط آنزیم رونوشتبرداری معکوس Meloney-murine - M-MuLV - leukemia virus - فرمنتاز، لیتوانی - و پرایمرهای Oligo - 18 - dT و رندوم هگزامر در حضور dNTP و RNA guard
نتایج
در مرحله اول آزمایش که عصاره گزنه به تنهایی در غذا به موشهای گروه شاهد و توموری داده شد، تغییر معناداری در رشد تومور - P=0/307 - دیده نشد. - p 0/05 -
در مرحله دوم ازمایش که عصاره گزنه همزمان در آب و غذا داده شد نیز به مانند مرحله اول تغییر معناداری در رشد تومور - p=0/348 - دیده نشد. - p 0/05 -
در مرحله سوم آزمایش که عصاره گزنه به صورت همزمان با تزریق سلولهای رده توموری در آب و غذای موشها تیمار شد، علیرغم تغییر در سایز تومورها و کوچکتر شدن اندازه تومور در مقایسه با گروه شاهد، به مانند سایر مراحل تغییر معناداری دررشد تومور - P=0/228 - دیده نشد.
