بخشی از مقاله
مطالعه برهم کنش پروتئینهاي آلفا و بتا کازئین با ویتامین ب12توسط روش طیف سنجی فلورسانس
چکیده
هدف مطالعه برهم کنش پروتئین هاي آلفا و بتا کازئین و ویتامین ب12 با استفاده از روش طیف سنجی فلورسانس است. کازئین یکی از مهمترین فسفو پروتئین هاي موجود در شیر پستانداران می باشد و از پپتید هاي آلفا، بتا و کا کازئین تشکیل شده است که نقش هاي مهمی در سلامت انسان از جمله کاهش کلسترول، خواص ضد سرطانی و اثرات ضد پرفشاري خون دارد. ویتامین ب12 نیز داراي خواص گوناگونی از جمله نقش در متابولیسم و سوخت و ساز بدن می باشد و کمبود آن خطراتی را در بدن از قبیل کم خونی مگالوبلاستیک ایجاد می کند. ازین رو برهم کنش میان این دو می تواند نقش مهمی در نقل و انتقالات ویتامین توسط پروتئین ایفا کند. در این مطالعه ویتامین ب12 می تواند با متصل شدن به پروتئین هاي آلفا و بتا کازئین به درون بدن منتقل شود. مطالعات انجام شده توسط این روش نشان می دهد که حضور ب12 باعث خاموشی نشر فلوروفور هاي هر دو پروتئین می شود که نشان از تشکیل کمپلکس لیگاند- پروتئین می باشد. از مطالعات انجام شده می توان این گونه استنباط کرد که ب12 با باند شدن به پروتئین می تواند به درون بدن منتقل شده و تاثیر دارویی خود را بر جاي گذارد.
کلمات کلیدي: آلفا کازئین، بتا کازئین، ب 12، طیف سنجی فلورسانس.
.1 مقدمه
کازئین مهمترین فسفو پروتئین شیر است که حدود %80 از کل پروتئین هاي شیر را به خود اختصاص می دهد، میسل ها ي کازئین شامل چهار نوع پروتئین بزرگ به نام هاي آلفا اس یک ، آلفا اس دو ، بتا و کا کازئین است. آلفا اس یک 22900 دالتون وزن مولکولی داشته و شامل 214 آمینواسید و بتا کازئین 23600 و 224 آمینو اسید دارد .[1] این پروتئینها ترکیباتی با مشخصات غذایی باارزشی هستند و به عنوان مکمل پروتئینی براي عملکردهاي مضاعف در فرآیندهاي غذایی مورد استفاده قرار می گیرد.[2]
ویتامین ب 12 کمپلکسی از کبالت و مولکولهاي حلقه ي کورین، شامل یک حلقه ي تتراپیرول است. این ویتامین داراي وزن مولکولی 3/1 کیلودالتون است. انسانها قادر به سنتز این ویتامین نیستند و آن را فقط از طریق جذب مواد غذایی به دست می آورند]٣.[
هدف از انجام این تحقیق بررسی بر هم کنش میان پروتئین هاي آلفا و بتا کازئین با ویتامین ب12 با استفاده از روش طیف سنجی فلورسانس می باشد. پروتئین هاي آلفا و بتا کازئین به عنوان پروتئینی حامل در نقل و انتقالات نقش مهمی دارند از این رو ویتامین ب12 می تواند با پیوند شدن، توسط این پروتئین به درون بدن حمل گردد.
.2 مواد و روش ها
یکی از روشهاي مطالعه مستقیم برهمکنش لیگاند با ماکرومولکول طیف سنجی فلورسانس میباشد که یکی از روش هاي پرکاربرد در زمینه بیوشیمی و بیوفیزیک مولکولی است.
دستگاه مورد استفاده براي اندازه گیري فلورسانس را فلورومتر، اسپکتروفلورومتر یا اسپکتروفتوفلورومتر می نامند. اجزاء سازنده دستگاههاي اندازه گیري فلوئورسانس ،شامل منبع نور، صافی و تکفام ساز، آشکارساز، سلول و محفظه ي سلول می باشد. در این دستگاه ابتدا نور از یک منبع مناسب به درون یک تکفام ساز یا صافی که وظیفه آن عبور بخشی از پرتو است می تابد. تابش فلوئورسان، توسط نمونه در تمام جهات نشر میشود، اما مناسبترین زاویه مشاهده آن ، زاویه قائمه نسبت به تابش تحریک است. در بقیه زوایا ، افزایش پراکندگی توسط محلول و دیوارههاي سلول احتمالا منجر به خطاهاي بزرگی در اندازه گیري شدت فلوئورسان میشود. تابش منتشره پس از عبور از درون یک سیستم صافی یا تکفامساز دوم که پیک فلوئورسان را مجزا میکند، به یک آشکارساز فتوالکتریک میرسد. خروجی آشکارساز تقویت میشود و بر روي یک ثبات یا یک نوسان نما نمایش داده میشود. این دستگاه معمولا داراي لامپ جیوه یا لامپ گزنون است که به عنوان منبع نور مورد استفاده قرار می گیرد، این لامپ ها در نواحی مرئی و ماوراي بنفش، تولید انرژي می نمایند. معمولا منبع نوري براي اکثر اسپکتروفلورومترها، قوس گزنون است که شدت زیادي بین 200- 900 نانومتر دارد. روشنایی تابعی از قدرت و اندازه ي قوس است. لامپ هاي قوسی براي سیستم هاي فلورسانسی معمولی داراي دامنه اي بین 450-750 وات هستند، براي کار با دستگاه ابتدا باید طول موج مورد نیاز مناسب را با استفاده از فیلتر و یا منوکروماتور انتخاب کرد و آن را به سل حاوي نمونه تاباند. سل حاوي نمونه معمولا از شیشه یا کوارتز می باشد. براي تجزیه باید پرتو منتشر شده بطور عمود بر پرتو تحریک کننده، مورد آزمایش قرار گیرد. بر این اساس دستگاه اسپکتروفلورومتر شامل منوکروماتور دیگري عمود بر منوکروماتور اصلی است که طول موج تابش ثابتی را فراهم می سازد این روش اندازه گیري، یعنی اندازه گیري فلورسانس منتشر شده در جهت عمود بر شعاع تابش منبع، مانع اندازه گیري شعاع هاي باقیمانده از شعاع تابش به همراه شعاع منتشره می گردد همچنین باعث به حداقل رسانیدن هر گونه خطا در شدت نور پراکنده شده از محلول نمونه و یا دیواره هاي سلول حاوي نمونه می شود. چون شدت امواج فلورسانس منتشر شده ضعیف می باشد، از یک آشکارساز خیلی حساس مانند فتومولتی پلایر استفاده می شود. سپس علایم ایجاد شده توسط ثبات به وسیله ي شاخص دستگاه که ممکن است یک گالوانومتر و یا یک ثبات باشد، ثبت شده و مورد استفاده قرار می گیرد. چنانچه به جاي دو منوکروماتور موجود در دستگاه از یک فیلتر استفاده شود، به دستگاه حاصل به جاي اسپکتروفلورومتر، فلورومتر گفته می شود. مسلما اسپکتروفلورومتر داراي دقت و حساسیت بیشتري است و استفاده از آن در زمینه تحقیقاتی بیشتر از فلورومتر می باشد. .[4-6]
به منظوربررسی برهمکنش ویتامین ب 12 وپروتئین آلفا و بتا کازئین گاوي ، آزمایش به این صورت انجام شد؛ ابتدادرسل مقدار 2 میلی لیترمحلول پروتئین کازیین با غلظت 1/3 ×10-2 میلی مولار ریخته وطیف نشري آن را در محدوده 300 تا 600نانومتردرطول موج تهییجی 280 نانومترگرفته، سپس به سل مقادیر5 ، 10 و 20 میکرولیتر از محلول ویتامین ب 12 با غلظت 0/5 میلی مولار اضافه شد وطیف آن پس از 3 دقیقه از زمان اضافه شدن، ثبت شد، این آزمایش تا 40 تزریق انجام
شد. آزمایش دیگري مشابه با همین آزمایش در طول موج تهییجی 295 نانومتر نیز انجام شد. این آزمایش براي هر دو پروتئین به طور جداگانه انجام شد.
.3نتایج و بحث
جهت بررسی نوع بر هم کنش ویتامین ب 12 و پروتئین هاي آلفا و بتا کازئین، نمودار شدت فلورسانس علیه طول موج نشري در طول موج هاي تهییج 280 و 295 نانومتر رسم شده است.شکل هاي (1) و (2) به ترتیب نمودار شدت فلورسانس پروتئین آلفا و بتا کازئین علیه طول موج نشري را در حضور ویتامین ب 12 نشان می دهد. طول موج تهییجی در اینجا 280 نانومتر می باشد. این طول موج مربوط به برانگیختی اسید هاي آمینه ي تریپتوفان و تیروزین است.
شکل :(1) ا ثر افزایش غلظت ب 12 بر روي طیف نشري آلفا کازئین گاوي در طول موج تحریکی 280 نانومتر و در دماي 298 درجه ي کلوین، بافر پتاسیم فسفات 50 میلی مولار، . pH= 7/4 جهت پیکان عمودي افزایش غلظت ب 12 و جهت پیکان افقی، انتقال قرمز را نشان می دهد.
شکل :(2) ا ثر افزایش غلظت ب 12 بر روي طیف نشري بتا کازئین گاوي در طول موج تحریکی 280 نانومتر و در دماي 298 درجه ي کلوین، بافر پتاسیم فسفات 50 میلی مولار، . pH= 7/4 جهت پیکان عمودي افزایش غلظت ب .12
با توجه به شکل هاي (1) و (2) همانطور که مشاهده می شود با افزایش غلظت ویتامین ب 12، شدت نشر هر دو پروتئین کاهش می یابد که به این فرآیند خاموشی وابسته به غلظت می گویند. همچنین در اثر پیوند شدن ویتامین ب12 به پروتیین آلفا کازئین، انتقال نشر ماکزیمم به سمت طول موج هاي بلندتر یعنی به سمت ناحیه ي قرمز مشاهده می شود. این انتقال زمانی رخ می دهد که اسید آمینه هاي تیروزین و تریپتوفان از محیط آبگریز به محیط آبدوست انتقال یابند، که این پدیده
نشان دهنده ي افزایش قطبیت محیط اطراف این دو کروموفور و کاهش آبگریزي می باشد8]و[7 ، همچنین می توان گفت که با اتصال ب12، فلوروفور هاي پروتئین به سطح آمده و محیطشان قطبی تر شده است. ولی در رابطه با پروتئین بتا کازئین
