بخشی از مقاله
بررسی اثر استریل سازی با پرتو گاما بر خواص القای استخوانسازی پودر دمینرالیزه استخوان آلوگرافت
چکیده
زمینه: یکی از روش های استریل سازی نهایی استخوانهای آلوگرافت استفاده از پرتو گاما می باشد. این مطالعه به منظور بررسی اثرات این پرتو با دوز ۲۰ کیلوگری، بر خواص القای استخوان سازی پودر استخوان دمینرالیزه انجام شده است. روش کار: این تحقیق به روش تجربی و در مدل حیوانی انجام شد. پودر استخوان دمینرالیزه استریل شده با پرتو گاما با دوز ۲۰ کیلو گرمی به مدت ۱۸ ساعت، به عنوان گروه مورد بررسی و پودر استخوان دمینرالیزه تهیه شده به روش استریل اولیه، به عنوان گروه شاهد در نظر گرفته شد. ۳۰ میلی گرم پودر استخوان از هر گروه به صورت مجزا در عضلات پاراورتبرال چپ و راست ۱۸ موش صحرایی کاشته شدند. پس از 4 هفته نمونه های پیوند شده همراه با حاشیه ۰ / ۵ سانتیمتر برداشت و قابلیت تحریک استخوان سازی در دو گروه با بررسی هیستوپاتولوژیک مقایسه گردید. ر یافته ها: در بررسی نمونه های شاهد بجز یک مورد در بقیه نمونه ها (۹۶
/4 ٪) شواهد تشكيل بافت جدید استخوانی دیده شد؛ که این تغییرات در گروه مورد بررسی تنها در ۵ نمونه (٪۲۷ / ۷ ) مشاهده گردید که این اختلاف از نظر آماری معنی دار بود. نتیجه گیری: با توجه به این که استفاده از پرتوگاما منجر به کاهش قابل توجه در خاصیت القای استخوان پودر استخوان دمینرالیزه میشود، استفاده از روش های استریل سازی جایگزین می تواند منجر به ارتقای کیفیت و اثر بخشی این محصول پیوندی شود.
واژگان کلیدی: آلوگرافت، القای استخوان سازی، پرتو گاما، پودر استخوان دمینرالیزه
مقدمه
امروزه پیوند استخوان آلوگرافت كاربرد فراوانی در رشته های مختلف علم پزشکی دارد. اعمال جراحی ارتوپدی، جراحی اعصاب، جراحیهای فک و صورت و دندانپزشکی نمونه هایی از حیطه کاربردی این رده از محصولات می باشند. سابقه پیوند استخوانالوگرافت به حدود ۱۰۰ سال قبل باز می گردد. در طی سالهای ۱۸۸۰ تا ۱۹۸۰ مشکل اصلی، تهیه استخوان آلوگرافت و اغلب پیوندها در این دوره از نوع اتوگرافت بود. اولین مورد پیوند استخوان آلوگرافت در سال ۱۸۸۱ توسط مک ایوان انجام گرفت. در طی این عمل قطعه ای از استخوان بازوی فرد مبتلا به استئومیلیت با استخوان الوگرافت جایگزین شد [۱] با توجه به استقبال روز افزون جراحان از محصولات پیوندی مشتق از استخوان آلوگرافت، توجه به اثربخشی و مطمئن بودن بافت پیوندی اهمیت ویژه دارد. امکان انتقال بیماریهای عفونی ویروسی از قبیل HIV 2&HTLV1,2&1، هپاتیت B وC، سیتومگالو ویروس و بیماریهای پریونی از طریق پیوند بافتهای آلوده انسانی در مطالعات مختلفی گزارش شده است. خطر انتقال این گونه بیماری ها در پیوند نسوج اسکلتی – عضلانی، ارتباط نزدیکی با روشهای فرآوری و نوع نسج مورد استفاده دارد [۴-۲]. خطر انتقال بیماری ها از طریق
ارزیابی و انتخاب صحیح اهداکننده، انجام تست های غربالگری، فرآوری صحیح و استفاده از روش های استریل سازی نهایی محصول، به حداقل می رسد [۵]. روشهای مختلفی برای استریل سازی نهایی استخوان آلوگرافت وجود دارد که از جمله آنها می توان به استریل سازی با پرتوهای پرانرژی، دمای بالا و مواد شیمیایی اشاره نمود. از سال ۱۹۵۰ میلادی مطالعات فراوانی در مورد
اثربخشی و عوارض سوء پرتو گاما بر روی استخوان های آلوگرافت، انجام شده است.
باید در نظر داشت که دوز بالای پرتو گاما تغییرات شیمیایی و فیزیکی متعددی در بافت ایجاد می کند که می تواند منجر به اختلال در خواص بیوفیزیک و بیولوژیک استخوان شود. با وجود این که ویروس ها بیشترین مقاومت را نسبت به پرتوتابی دارند، در مطالعاتی مشخص شده است که در صورت استفاده از روشها و دوز مناسب و کافی اشعه، ویروس های HCVو HIV موجود در بافت های اسکلتی – عضلانی، از بین می روند [۶]. هیلمی و همکاران اثر بخشی بالینی استخوان های بلند را که در معرض ۲۵ کیلوگری پرتو گاما قرار گرفته بودند، مورد مطالعه قرار دادند که تفاوت معنی داری با استخوان های آسپتیک نداشتند [۷]. انجمن
نسج اروپا و آژانس بین المللی انرژی اتمی دوز ۲۵ کیلوگری و انجمن بانکهای نسج آمریکا حداقل دوز بیش از ۱۵ کیلوگری را، قابل قبول می دانند. [۱۰-۸). برخی از صاحب نظران دوز ۳۵ کیلوگری را پیشنهاد می کنند [۱۱]. در مطالعه گلواکی و مولی کن اثر روشهای مختلف فرآوری بر خواص القای استخوان سازی، بررسی شد [۱۲]. يوریسته و هرناندز نشان دادند که تابش گاما در حد ۴۰ کورتیکال آلوگرافت با دوز ۲۷ / ۵ کیلوگری، در مقابل نیروهای کششی و فشارنده نسبت به گروه کنترل، کاهش مقاومت معنی داری دارند [۱۶].
با توجه به نظرات مختلف در مورد اثرات پرتو گاما بر خواص زیستی استخوان آلوگرافت و مشتقات آن، این مطالعه با هدف بررسی اثرات پرتو گاما به عنوان روش استریل کننده ثانویه، بر خاصیت القای استخوان سازی پودر استخوان دمینرالیزه انجام شده است.
روش کار این تحقیق به روش تجربی در مدل حیوانی، در مرکز تحقیقات و بانک فرآورده های پیوندی ایران و بخش هیستوپاتولوژی انستیتو کانسر بیمارستان امام خمینی، از فروردین ماه سال ۱۳۷۹ لغایت اردیبهشت ماه سال ۱۳۸۳ انجام شد.
آلوگرافتهای استخوانی منطبق با دستورالعمل های استاندارد شده از سوی بانک فرآورده های پیوندی ایران و پس از کسب رضایت آگاهانه از اولیای دم، تا ۲۴ ساعت پس از فوت برداشت شدند. نمونه ها از دیافیز استخوان فمور تهیه شدند و از هر نمونه به طور مساوی دو قسمت طولی، انتخاب و تحت آماده سازی قرار گرفت. با توجه به انجام مطالعه بر روی آلوگرافت های استخوان انسانی و محدودیت تهیه این آلوگرافتها برای بیماران کاندید پیوند استخوان و وجود لیست انتظار، تنها آلوگرافت هایی برای این مطالعه انتخاب شدند که طبق بررسیهای آزمایشگاهی به دلیل آلودگی با مارکرهای ویروسی، غیرقابل پیوند بودند. با توجه به این که نمونه های مورد استفاده در مطالعه از نظر آلودگی ویروسی مثبت بودند؛ محققین نسبت به این مطلب آگاهی کامل داشته و در طول مدت تحقیق رعایت کلیه اصول و مراقبت های لازم در تماس با مایعات و مواد مشکوک، الزامی بوده و هر گونه وسیله مصرفی قبل از عملیات استفاده مجدد و پس از دفع ضایعات و رفع آلودگی، با محلول استریل کننده کارخانه دکونکس یا تحت استریل سازی با بخار، قرار می گرفتند. جهت تهیه پودر استخوان دمینرالیزه ابتدا نمونه های تنه فمور از انتهای قسمت کورتیکال با اره ارتوپدی ساخت کارخانه استریکر به صورت چوب کبریتی برش داده شدند. قطعات با سطح مقطع ۴-۲ میلیمتر در هر بعد تهيه شده، با استفاده از دنده بر به قطعات کوچکتر از ۲ میلی متر تبدیل شدند. سپس با دستگاه آسیاب استخوان IKA آلمان تبدیل به ذرات پودری شدند. برای این کار از دو نوع فیلتر استیل زنگ نزن با قطر سوراخ ۱۵۰ میکرومتر و ۷۵۰ میکرو متر، جهت جداسازی ذرات حد فاصل این دو اندازه، استفاده شد. در مرحله دمینرالیزاسیون، نمونه های پودری تهیه شده به مدت سه ساعت تحت اثر اسید کلریدریک ۰ / ۵ نرمال (کمپانی Merck المان) قرار گرفتند تا میزان کلسیم به زیر ٪۱۰ برسد. سپس اسید باقیمانده با آب فوق خالص بدون اندوتوکسین، شسته شد. این کار حداقل ۶ مرتبه (بسته به حجم پودر) انجام شد که در صورت رسیدن PH به ۷-۶
دوز ۲۵ کیلوگری پرتو گاماو به مدت ۱۸ ساعت انجام گرفت. نمونه های استریل شده با پرتوگاما پس از تحویل، همانند نمونه های
شاهد تا زمان پیوند در فریزر ۸۶- درجه سانتی گراد ( کمپانی New Brunswick آمریکا) نگهداری شدند. برای پیوند نمونه ها از تعداد ۱۸ سر موش صحرایی ماده با سن ۶ هفته استفاده شد که به صورت مجزا در قفس نگهداری می شدند و آب و غذای مناسب برای آنها تأمین می شد. محل نگهداری موش ها، آزمایشگاه حیوانات مرکز تحقیقات سرطان بیمارستان امام خمینی بود.
برای انجام پیوند، موشها با کمپلکس دیازپام و کتامین با تزریق داخل پریتوئن به مدت ۴۵-۳۰ دقیقه بیهوش شدند. پس از زدودن موهای محل عمل، و تمیز کردن موضع جراحی با بتادین ۱۰٪، در پشت هر کدام از موشها برش طولی به طول ۳ سانتی متر در خط وسط بر روی پوست ایجادشده، پس از مشخص شدن عضلات پارا ورتبرال در هر طرف عضله، کیسه ای به صورت جداسازی غیرنافذا درون عضله ایجاد شد و ۳۰ میلی گرم از نمونه های A و B به صورت تصادفی و مجزا از هم در سمت چپ و راست و در محل کیسه عضلانی ایجاد شده، کاشته شدند. جهت جلوگیری از شسته شدن نمونه ها در اثر خونریزی مرتبأ کیسه ایجادشده با گاز استریل پاک میشد و در صورت مخلوط شدن یا شسته شدن نمونه با خون، تمام محتویات کیسه خارج شده و مجددا عملیات کاشت انجام می شد. پس از پیوند نمونهها، شکاف فاسیای عضله بانخ نایلون ۴ / ۰ و پوست بانخ نایلون ۲/ ۰ به صورت مجزا بخیه زده شد و با چسب لکوپلاست کاملا روی محل بخیه پوشانده شد؛ تا جلوی جویده شدن احتمالی بخیه توسط موش گرفته شود. این چسب در مراقبت های روزانه موشها، مرتبا چک می شد. در تمام مدت عمل تا مرحله هوشیاری، موشها روی تخت دارای گرم کن نگه داشته شدند و نگهداری روزانه تا مدت ۴ هفته انجام شد. موش های آماده شده پس از ۴ هفته و با استنشاق گاز CO2 (بافشار ۱اتمسفر)، در عرض نیم ساعت و بدون درد، کشته شدند. نمونه ها بلافاصله توسط فرد پیوند کننده با باز کردن بخیه های محل کاشت با ۰ / ۵ سانتیمتر از حاشیه اطراف برداشته شدند. هر نمونه به صورت جداگانه در فرمالین ۱۰٪ (کارخانه Merck آلمان) قرار داده شد و جهت انجام بررسی هیستوپاتولوژی به بخش هیستوپاتولوژی مرکز تحقیقات سرطان بیمارستان امام خمینی، ارسال شد. نمونه ها جهت بررسی، تحت عملیات تهیه لام و رنگ آمیزی H& Eقرار گرفتند.
کلیه نمونه ها توسط یک آسیب شناس از نظر ایجاد بافت استخوانی جدید به صورت بافته شده یا لایه ای، وجود بافت غضروفی جدید، سلولهای استئوبلاست و عناصر سلولی مغز استخوان، بررسی شدند. نمونه های حاوی بافت استخوانی زنده، از نظر القاء استخوان سازی مثبت و نمونه های حاوی پودر دمینرالیزه استخوان بدون سلول استخوانی، منفی گزارش شدند. جهت
فقدان سلول های استئوبلاست یا استئوسیت زنده و ایجاد بافت فیبرو همراه با استئوکلاست، دلیلی بر عدم ایجاد استخوان جدید در نظر گرفته شد. پس از بررسی، تشکیل بافت استخوانی زنده که نشان دهنده اثر القای استخوان سازی پودر استخوان کاشته شده است، در ۱۷ نمونه (۹۴/۴٪) از گروه شاهد دیده شد (شکل ۱) و در گروه استریل شده با پرتو گاما به جز پنج نمونه (٪۲۷ / ۷ )، در بقیه موارد مشاهده نشد (شکل ۲). در بررسی های آماری این اختلاف معنی دار بود ( ۰ / ۰۰۲> P). تشکیل کندروسیت در گروه شاهد ۵ / ۵% و در گروه مورد بررسی، مشاهده نشد و تشکیل استئوبلاست در گروه شاهد ۸۸ /۸ ٪و در گروه مورد بررسی، ۵۰٪ بود. اختلاف تشکیل کندروسیت و استئوبلاست نیز از نظر آماری معنی دار بود ( ۰/ ۰۵>P).
