بخشی از مقاله
مقدمه
مرگ برنامه ریزي شده یا آپویتوز به فرآیند فعال وابسته به برون سلولی اطلاق میشود. سلولهاي زنده با روندي
انرژي، آغاز شده بوسیله محرکهاي مختلف درون سلولی و سازمان یافته در مرگ خود شرکت میکنند. آپوپتوز در
186
myeloma cell line)
مجله پژوهشهاي سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 2، 1392
مقایسه با مرگ سازمان نیافته سلول، یعنی نکروز، فرآیندي به دقت سازماندهی شده و هوشمند میباشد. از خصوصیات بارز آپوپتوز قطعه قطعه شدن DNA و هسته می باشد که در نکروز این حالت مشاهده نمی شود .(25)
با توجه به اینکه کربوهیدراتها در سطح خارجی غشاء سلول وجود دارند، می توانند براي سلول فاکتور هاي تشخیصی مناسبی در محیط اطرافش باشند. سلولها از طریق کربوهیدراتهاي موجود در سطح خود با ماتریکس خارج سلولی و سلولهاي مشابه و یا متفاوت ارتباط برقرار می کنند .(26) بنابراین ترکیبات کربوهیدراتی مولکولهاي مناسبی براي مطالعه روي سلولهاي سرطانی می باشند 4)، 5، 6، 7 و .(17 به کاربردن یک زنجیره قندي کوتاه یا بلند، می تواند فرآیند بازشناسی طبیعی سلولها را تحت تأثیر قرار دهد و به این صورت مانع پیشرفت تومور شود .(18) این ممانعت از راههاي زیر صورت می پذیرد:
• دخالت این ترکیبات در ارتباط بین سلول با سلول دیگر و یا سلول با ماتریکس خارج سلولی
• دخالت این ترکیبات قندي در ممانعت از آنژیوژنز در سلولهاي سرطانی
• جلوگیري از تهاجمی شدن تومور و متاستازي شدن آنها
پکتینها از مواد اصلی تشکیل دهنده دیواره سلولی در سلولهاي گیاهی هستند. این ماده پلی ساکارید بسیار منشعب و پیچیده است و داراي تعداد زیادي زیر واحدهاي گالاکتوزید می باشد .(18)
از پکتین مرکبات (Citrus pectin (CP)) پس از تغییرات در دما و pH ، نوعی پکتین تغییر یافته Modified) (Citrus Pectin (MCP) تهیه می شود که می تواند علاوه بر مهار رشد سلولهاي سرطانی، از طریق القاي آپوپتوز در این سلولها، باعث مهار متاستاز و مهاجرت آنها به سایر نقاط بدن گردد 11)، 12، 13 و .(14 شکسته شدن این پلی
ساکارید در طی تغییرات دما و pH انجام شده و بدین ترتیب مولکولی کوتاه تر ایجاد می شود. کوتاه تر شدن زنجیره هاي CP می تواند عامل مؤثري در افزایش قدرت آپوپتوتیکی و آنتی متاستازیکی MCP نسبت به CP باشد
20) و.(21
تحقیقات نشان داده که، شکسته شدن ملکول CP به وسیله تغییر در دما باعث القاي آپوپتوز و با تغییر در pH باعث جلوگیري از متاستاز می شود. با ترکیب این دو روش، می توان هر دو پتانسیل فعالیت آپوپتوتیکی و ضد متاستازي را در CP ایجاد کرد .(10)
در سال 2003 اثر آپوپتوزي ترکیبات پکتینی بر روي سلولهاي ادنوکارسینوماي کولون انسانی HT29 توسط محققین نشان داده شد .(19) در سال 2005 نیز در بررسی اثر MCP روي دودمانهاي سلولی میلوما (multiple
مشاهده کردند که این کربوهیدرات
قادر به القاي آپوپتوز در این دودمانهاي سلولی، که مقاوم به سایر روشهاي متداول درمانی هستند، می باشد. در ضمن، این محققین نشان دادند که، MCP قادر به القاي آپوپتوز در سلولهاي طبیعی لنفوسیت نیست .(8)
پس از آن، در سال 2007 اثر آپوپتوتیکی FPP
(fractionated pectin powder)، که با اثر دادن حرارت از پکتین مرکبات (CP) حاصل می شود، روي سلولهاي سرطان پروستات انسانی LNCaP و LNCaP C4-2 نشان داده شد .(16) در ضمن، در این پژوهش مشاهده کردند که، مواد پکتینی قادر به القاي آپوپتوز در سلولهاي طبیعی بدن مثل اندوتلیال رگی HUVEC، نیستند. پس از آن محققین در سال 2010 اثر آپوپتوزي دو نوع از پکتین مرکبات تغییر یافته Pectasol-C) و (Pectasol را بر دو دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی وابسته به آندروژن
(LNCaP) و غیر وابسته به آندروژن (PC3) نشان دادند
.(27)
187
مجله پژوهشهاي سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 2، 1392
اسید پکتیک یا آلفا دي پلی گالاکتورونیک اسید، پکتینی است که در دیواره سلولهاي گیاهی یافت می شود.
بررسیهاي انجام شده نشان داده است که، اسید پکتیک روي دودمان سلولی GH3/B6، که سلولهاي توموري هیپوفیز موش می باشند، اثر آپوپتوزي دارد .(3)
با توجه به این نکته که سرطان پروستات شایع ترین نوع سرطان در مردان می باشد و همچنین نظر به کاربرد مشتقات پکتینی در جلوگیري از پیشرفت و رشد سلولهاي سرطانی و این ویژگی اسید پکتیک که در مقایسه با پکتین مرکبات ساختار ساده تري دارد.
تحقیق حاضر اثر آپوپتوزي یا نکروزي این ماده روي دودمان سلولی سرطان پروستات را مورد بررسی قرار می دهد. از میان دودمانهاي سلولی سرطان پروستات که معمولا" در تحقیقات مورد استفاده قرار می گیرند PC3)، DU145، (LNCaP، دودمان سلولی DU145 انتخاب شد.
این دودمان سلولی غیر وابسته به آندروژن است.
در معالجه سرطان از شیمی درمانی استفاده می شود که معمولا" داراي عوارض جانبی است. بنابراین اگر موادي طبیعی بتوانند مقداردز مؤثر این دارو هاي شیمیایی را کاهش دهند قدم مهمی در این راه برداشته شده است. در این تحقیق، با تغییر pH و دما در اسید پکتیک (پکتین سیب) و پکتین مرکبات، مشتق تغییر یافته اي از این دو نوع پکتین به دست آمد و اثر آپوپتوزي هر دو پکتین قبل و بعد از تغییر، روي سلولهاي سرطان پروستاتDU145،
مورد مطالعه قرار گرفت.
مواد و روشها
کشت سلولهاي :DU145 سلولهاي DU145 به صورت یک لایه (monolayer) در محیط کشت RPMI 1640 و 10
درصد سرم جنین گاو غیر فعال شده کشت داده شدند.
تهیه پکتین تغییر یافته: تهیه MCP از CP با توجه به روش
انجام شده توسط آوراهام راز (Avraham Raz) و
همکارانش در سال 2002 صورت پذیرفت .(22) این روش به طور خلاصه بدین صورت انجام می گیرد، محلول
1/5 درصد CP به 10 pH رسانده می شود و در دماي 55
درجه سانتی گراد به مدت 1 ساعت نگهداري می گردد و سپس pH آن تا 3 کاهش می یابد. پس از یک شب نگهداري در محیط آزمایشگاه در روز بعد اتانل 95 درصد به آن اضافه شده و در دماي -20 به مدت 2 ساعت انکوبه می گردد. محلول ژلاتینی حاصل از روي کاغذ صافی
(Whatman) عبور داده شده و در دماي محیط خشک
می شود.
اثر دادن مشتقات پکتینی: مشتقات پکتینی به کار رفته در
این تحقیق عبارتند از : AP (Acid Pectic) ، MAP
(Modified Acid Pectic) ، CP، MCP و MCP) Pectasol
تجارتی). به منظور تعیین اثر غلظتهاي مختلف مشتقات پکتینی بر سلولهاي DU145 ، تعداد × 106 ۵/٠ سلول به همراه 1ml محیط کامل در هر یک از چاهکهاي مولتی دیشهاي 12 خانه اي کشت داده شدند. مدت زمان پیش انکوباسیون براي سلولها 24 ساعت در نظر گرفته شد. بعد از این مدت محیط رویی سلولها خارج و محیطهاي حاوي غلظتهاي 0/01 mg/ml، 0/1، 0/5، 1، 3، 5 مشتقات پکتینی به آنها اضافه گردید. مدت انکوباسیون تیمارهاي مذکور 24 و 48 ساعت در نظر گرفته شد.
رنگ آمیزي سلولها با روش گیمسا: به منظور رنگ آمیزي گیمسا، سلولها روي لامل کوچک به قطر 1 سانتیمتر کشت داده می شوند. سلولها پس از شستشو با PBS به وسیله متانول به مدت 10 دقیقه تثبیت می گردند. در این رنگ آمیزي، رنگ گیمسا با غلظت 0/8 درصد مورد استفاده قرار گرفت. سلولها با استفاده از میکروسکوپ نوري مشاهده و عکسبرداري شدند .(23)
188
مجله پژوهشهاي سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 2، 1392
رنگ آمیزي هسته با اکریدین اورنج و اتیدیوم برماید:
تعلیق یا سوسپانسیون سلولهاي تیمار شده با مواد پکتینی در PBS انجام گرفت. به این سلولها محلول اکریدین اورنج/ اتیدیوم برماید با غلظت 100 µg/ml اضافه گردید و به وسیله میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شدند. براي تعیین درصد سلولهاي آپوپتوتیک حداقل 300 سلول شمارش شد.
بررسی چرخه سلولی: سلولهاي تیمار شده با مواد پکتینی به وسیله اتانول 70 درصد سرد به مدت 2 ساعت تثبیت
می گردند. سپس به آنها 1ml محلول PI MASTER MIX
که حاوي PI(Propidium Iodide) 40μl، RNase 10μl، PBS 950μl می باشد، اضافه شده و به مدت 30 دقیقه در دماي 37 درجه سانتی گراد انکوبه می گردند. پس از آن، توسط دستگاه فلوسایتومتري مورد بررسی قرار گرفته و داده ها توسط نرم افزار WINMDI آنالیز شدند.
الف ب
شکل -1 در تصویر الف، مورفولوژي طبیعی سلولهاي DU145 بدون هیچ تیمار ویژه اي، به وسیله رنگ آمیزي گیمسا، قابل مشاهده می باشد. در تصویر ب، تغییرات مورفولوژیکی سلولها پس از تیمار با 5 mg/ml اسید پکتیک و رنگ آمیزي گیمسا، نشان داده شده است. کاهش حجم سلول ، گرانوله شدن سلولها و همچنین چروکیده شدن غشاي سلولها در این تصویر قابل مشاهده می باشد.
الف ب
شکل -2 تغییرات مورفولوژیکی سلولها پس از تیمار با .MCP 5 mg/ml کاهش حجم سلول، گرانوله شده سلولها و چروکیده شدن غشاي سلولی در این تصاویر، قابل مشاهده می باشد. (MCP=Modified Citrus Pectin)
189
مجله پژوهشهاي سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 2، 1392
الف ب ج
د ه و
شکل -3 نمونه هایی از تصاویر میکروسکوپ فلورسنت از سلولهاي DU145، پس از تیمار با بالاترین غلظتهاي مشتقات پکتینی و رنگ آمیزي با
اتیدیوم برماید و آکریدین اورنج. (الف) سلولهاي DU145 به عنوان کنترل منفی، (ب) این سلولها پس از 48 ساعت تیمار با AP 5 mg/ml، (ج) پس از 48 ساعت تیمار با MAP 5 mg/ml، (د) پس از 48 ساعت تیمار با CP 5 mg/ml، (ه) پس از 48 ساعت تیمار با MCP 5 mg/ml،
(و) پس از 48 ساعت تیمار با Pectasol 3 mg/ml را نشان می دهد. در این شکلها سلولهایی که در مراحل آپوپتوز اولـیه ( Early apoptotic ( cells هستند توسط پیکانهاي سفید ) و سلولهایی که در مراحل آپوپتوز پیشرفته ( ( Late apoptotic cells می باشند توسط پیکانهاي خط چین سفید ( نشان داده شده اند. در ضمن ( ) سفید سلولهاي نکروزي و ( ) سفید سلولهاي طبیعی را نشان می دهند. ( AP=Acid pectic، MAP=Modified Acid Pectic، CP=Citrus Pectin، (MCP=Modified Citrus Pectin
آنالیز آماري: آنالیزهاي آماري با استفاده از نرم افزار 13 SPSS و تست پارامتریک ANOVA یک طرفه انجام شده
است.
P ≤ 0/05 به عنوان اختلاف معنی دار محاسبه شده است و نتایج به صورت ± SEM میانگین (n =3) نشان داده شده است.
نتایج
رنگ آمیزي سلولها با روش گیمسا: به منظور بررسی دقیق تر تغییرات مورفولوژیکی سلولهاي DU145 پس از تیمار مشتقات پکتینی، تعداد 5×105 سلول را روي لامل کوچک به قطر 1 سانتیمتر کشت داده و سپس توسط غلظتهاي 0/01، 0/1، 0/5، 1، 3 و mg/ml 5 از مشتقات پکتینی تیمار شد. پس از گذشت 48 ساعت از تیمار
سلولها، آنها را رنگ آمیزي گیمسا نموده و به وسیله میکروسکوپ نوري مورد بررسی قرار گرفت. مورفولوژي سلولها پس از این مدت در نمونه شاهد کاملاً طبیعی است و سلولها به کف فلاسک چسبیده و کشیده شده اند و برخی از سلولها نیز در حال تقسیم می باشند. غلظتهاي مختلف CP تغییر خاصی در مورفولوژي سلولها ایجاد نکردند. در نمونه هاي با غلظت پایینAP، MAP، MCP، 0/01) Pectasol، 0/1، (mg/ml 0/5 نیز تغییري در مورفولوژي نسبت به سلولهاي شاهد مشاهده نگردید. اما سلولهاي تحت تیمار با غلظتهاي بالاي اسید پکتیک، MCP
و 1 ) Pectasol، 3 و (mg/ml 5 تغییرات مورفولوژیکی زیر را نشان دادند:
