دانلود مقاله بررسی اثر مشتقات پکتینی در القای مرگ برنامه ریزی شده یا آپوپتوز در دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی DU145

word قابل ویرایش
14 صفحه
دسته : اطلاعیه ها
9700 تومان
97,000 ریال – خرید و دانلود

مقدمه

مرگ برنامه ریزی شده یا آپویتوز به فرآیند فعال وابسته به برون سلولی اطلاق میشود. سلولهای زنده با روندی
انرژی، آغاز شده بوسیله محرکهای مختلف درون سلولی و سازمان یافته در مرگ خود شرکت میکنند. آپوپتوز در
۱۸۶

myeloma cell line)
مجله پژوهشهای سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۲، ۱۳۹۲

مقایسه با مرگ سازمان نیافته سلول، یعنی نکروز، فرآیندی به دقت سازماندهی شده و هوشمند میباشد. از خصوصیات بارز آپوپتوز قطعه قطعه شدن DNA و هسته می باشد که در نکروز این حالت مشاهده نمی شود .(۲۵)

با توجه به اینکه کربوهیدراتها در سطح خارجی غشاء سلول وجود دارند، می توانند برای سلول فاکتور های تشخیصی مناسبی در محیط اطرافش باشند. سلولها از طریق کربوهیدراتهای موجود در سطح خود با ماتریکس خارج سلولی و سلولهای مشابه و یا متفاوت ارتباط برقرار می کنند .(۲۶) بنابراین ترکیبات کربوهیدراتی مولکولهای مناسبی برای مطالعه روی سلولهای سرطانی می باشند ۴)، ۵، ۶، ۷ و .(۱۷ به کاربردن یک زنجیره قندی کوتاه یا بلند، می تواند فرآیند بازشناسی طبیعی سلولها را تحت تأثیر قرار دهد و به این صورت مانع پیشرفت تومور شود .(۱۸) این ممانعت از راههای زیر صورت می پذیرد:

• دخالت این ترکیبات در ارتباط بین سلول با سلول دیگر و یا سلول با ماتریکس خارج سلولی

• دخالت این ترکیبات قندی در ممانعت از آنژیوژنز در سلولهای سرطانی

• جلوگیری از تهاجمی شدن تومور و متاستازی شدن آنها
پکتینها از مواد اصلی تشکیل دهنده دیواره سلولی در سلولهای گیاهی هستند. این ماده پلی ساکارید بسیار منشعب و پیچیده است و دارای تعداد زیادی زیر واحدهای گالاکتوزید می باشد .(۱۸)

از پکتین مرکبات (Citrus pectin (CP)) پس از تغییرات در دما و pH ، نوعی پکتین تغییر یافته Modified) (Citrus Pectin (MCP) تهیه می شود که می تواند علاوه بر مهار رشد سلولهای سرطانی، از طریق القای آپوپتوز در این سلولها، باعث مهار متاستاز و مهاجرت آنها به سایر نقاط بدن گردد ۱۱)، ۱۲، ۱۳ و .(۱۴ شکسته شدن این پلی

ساکارید در طی تغییرات دما و pH انجام شده و بدین ترتیب مولکولی کوتاه تر ایجاد می شود. کوتاه تر شدن زنجیره های CP می تواند عامل مؤثری در افزایش قدرت آپوپتوتیکی و آنتی متاستازیکی MCP نسبت به CP باشد

۲۰) و.(۲۱

تحقیقات نشان داده که، شکسته شدن ملکول CP به وسیله تغییر در دما باعث القای آپوپتوز و با تغییر در pH باعث جلوگیری از متاستاز می شود. با ترکیب این دو روش، می توان هر دو پتانسیل فعالیت آپوپتوتیکی و ضد متاستازی را در CP ایجاد کرد .(۱۰)

در سال ۲۰۰۳ اثر آپوپتوزی ترکیبات پکتینی بر روی سلولهای ادنوکارسینومای کولون انسانی HT29 توسط محققین نشان داده شد .(۱۹) در سال ۲۰۰۵ نیز در بررسی اثر MCP روی دودمانهای سلولی میلوما (multiple

مشاهده کردند که این کربوهیدرات

قادر به القای آپوپتوز در این دودمانهای سلولی، که مقاوم به سایر روشهای متداول درمانی هستند، می باشد. در ضمن، این محققین نشان دادند که، MCP قادر به القای آپوپتوز در سلولهای طبیعی لنفوسیت نیست .(۸)

پس از آن، در سال ۲۰۰۷ اثر آپوپتوتیکی FPP

(fractionated pectin powder)، که با اثر دادن حرارت از پکتین مرکبات (CP) حاصل می شود، روی سلولهای سرطان پروستات انسانی LNCaP و LNCaP C4-2 نشان داده شد .(۱۶) در ضمن، در این پژوهش مشاهده کردند که، مواد پکتینی قادر به القای آپوپتوز در سلولهای طبیعی بدن مثل اندوتلیال رگی HUVEC، نیستند. پس از آن محققین در سال ۲۰۱۰ اثر آپوپتوزی دو نوع از پکتین مرکبات تغییر یافته Pectasol-C) و (Pectasol را بر دو دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی وابسته به آندروژن

(LNCaP) و غیر وابسته به آندروژن (PC3) نشان دادند

.(۲۷)

۱۸۷

مجله پژوهشهای سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۲، ۱۳۹۲

اسید پکتیک یا آلفا دی پلی گالاکتورونیک اسید، پکتینی است که در دیواره سلولهای گیاهی یافت می شود.

بررسیهای انجام شده نشان داده است که، اسید پکتیک روی دودمان سلولی GH3/B6، که سلولهای توموری هیپوفیز موش می باشند، اثر آپوپتوزی دارد .(۳)
با توجه به این نکته که سرطان پروستات شایع ترین نوع سرطان در مردان می باشد و همچنین نظر به کاربرد مشتقات پکتینی در جلوگیری از پیشرفت و رشد سلولهای سرطانی و این ویژگی اسید پکتیک که در مقایسه با پکتین مرکبات ساختار ساده تری دارد.

تحقیق حاضر اثر آپوپتوزی یا نکروزی این ماده روی دودمان سلولی سرطان پروستات را مورد بررسی قرار می دهد. از میان دودمانهای سلولی سرطان پروستات که معمولا” در تحقیقات مورد استفاده قرار می گیرند PC3)، DU145، (LNCaP، دودمان سلولی DU145 انتخاب شد.

این دودمان سلولی غیر وابسته به آندروژن است.

در معالجه سرطان از شیمی درمانی استفاده می شود که معمولا” دارای عوارض جانبی است. بنابراین اگر موادی طبیعی بتوانند مقداردز مؤثر این دارو های شیمیایی را کاهش دهند قدم مهمی در این راه برداشته شده است. در این تحقیق، با تغییر pH و دما در اسید پکتیک (پکتین سیب) و پکتین مرکبات، مشتق تغییر یافته ای از این دو نوع پکتین به دست آمد و اثر آپوپتوزی هر دو پکتین قبل و بعد از تغییر، روی سلولهای سرطان پروستاتDU145،

مورد مطالعه قرار گرفت.

مواد و روشها

کشت سلولهای :DU145 سلولهای DU145 به صورت یک لایه (monolayer) در محیط کشت RPMI 1640 و ۱۰
درصد سرم جنین گاو غیر فعال شده کشت داده شدند.

تهیه پکتین تغییر یافته: تهیه MCP از CP با توجه به روش

انجام شده توسط آوراهام راز (Avraham Raz) و

همکارانش در سال ۲۰۰۲ صورت پذیرفت .(۲۲) این روش به طور خلاصه بدین صورت انجام می گیرد، محلول

۱/۵ درصد CP به ۱۰ pH رسانده می شود و در دمای ۵۵

درجه سانتی گراد به مدت ۱ ساعت نگهداری می گردد و سپس pH آن تا ۳ کاهش می یابد. پس از یک شب نگهداری در محیط آزمایشگاه در روز بعد اتانل ۹۵ درصد به آن اضافه شده و در دمای -۲۰ به مدت ۲ ساعت انکوبه می گردد. محلول ژلاتینی حاصل از روی کاغذ صافی

(Whatman) عبور داده شده و در دمای محیط خشک

می شود.

اثر دادن مشتقات پکتینی: مشتقات پکتینی به کار رفته در

این تحقیق عبارتند از : AP (Acid Pectic) ، MAP

(Modified Acid Pectic) ، CP، MCP و MCP) Pectasol

تجارتی). به منظور تعیین اثر غلظتهای مختلف مشتقات پکتینی بر سلولهای DU145 ، تعداد × ۱۰۶ ۵/٠ سلول به همراه ۱ml محیط کامل در هر یک از چاهکهای مولتی دیشهای ۱۲ خانه ای کشت داده شدند. مدت زمان پیش انکوباسیون برای سلولها ۲۴ ساعت در نظر گرفته شد. بعد از این مدت محیط رویی سلولها خارج و محیطهای حاوی غلظتهای ۰/۰۱ mg/ml، ۰/۱، ۰/۵، ۱، ۳، ۵ مشتقات پکتینی به آنها اضافه گردید. مدت انکوباسیون تیمارهای مذکور ۲۴ و ۴۸ ساعت در نظر گرفته شد.

رنگ آمیزی سلولها با روش گیمسا: به منظور رنگ آمیزی گیمسا، سلولها روی لامل کوچک به قطر ۱ سانتیمتر کشت داده می شوند. سلولها پس از شستشو با PBS به وسیله متانول به مدت ۱۰ دقیقه تثبیت می گردند. در این رنگ آمیزی، رنگ گیمسا با غلظت ۰/۸ درصد مورد استفاده قرار گرفت. سلولها با استفاده از میکروسکوپ نوری مشاهده و عکسبرداری شدند .(۲۳)

۱۸۸

مجله پژوهشهای سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۲، ۱۳۹۲

رنگ آمیزی هسته با اکریدین اورنج و اتیدیوم برماید:

تعلیق یا سوسپانسیون سلولهای تیمار شده با مواد پکتینی در PBS انجام گرفت. به این سلولها محلول اکریدین اورنج/ اتیدیوم برماید با غلظت ۱۰۰ µg/ml اضافه گردید و به وسیله میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شدند. برای تعیین درصد سلولهای آپوپتوتیک حداقل ۳۰۰ سلول شمارش شد.

بررسی چرخه سلولی: سلولهای تیمار شده با مواد پکتینی به وسیله اتانول ۷۰ درصد سرد به مدت ۲ ساعت تثبیت

می گردند. سپس به آنها ۱ml محلول PI MASTER MIX

که حاوی PI(Propidium Iodide) 40μl، RNase 10μl، PBS 950μl می باشد، اضافه شده و به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه می گردند. پس از آن، توسط دستگاه فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گرفته و داده ها توسط نرم افزار WINMDI آنالیز شدند.

الف ب

شکل -۱ در تصویر الف، مورفولوژی طبیعی سلولهای DU145 بدون هیچ تیمار ویژه ای، به وسیله رنگ آمیزی گیمسا، قابل مشاهده می باشد. در تصویر ب، تغییرات مورفولوژیکی سلولها پس از تیمار با ۵ mg/ml اسید پکتیک و رنگ آمیزی گیمسا، نشان داده شده است. کاهش حجم سلول ، گرانوله شدن سلولها و همچنین چروکیده شدن غشای سلولها در این تصویر قابل مشاهده می باشد.

الف ب

شکل -۲ تغییرات مورفولوژیکی سلولها پس از تیمار با .MCP 5 mg/ml کاهش حجم سلول، گرانوله شده سلولها و چروکیده شدن غشای سلولی در این تصاویر، قابل مشاهده می باشد. (MCP=Modified Citrus Pectin)

۱۸۹

مجله پژوهشهای سلولی و ملکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۶، شماره ۲، ۱۳۹۲

الف ب ج

د ه و

شکل -۳ نمونه هایی از تصاویر میکروسکوپ فلورسنت از سلولهای DU145، پس از تیمار با بالاترین غلظتهای مشتقات پکتینی و رنگ آمیزی با

اتیدیوم برماید و آکریدین اورنج. (الف) سلولهای DU145 به عنوان کنترل منفی، (ب) این سلولها پس از ۴۸ ساعت تیمار با AP 5 mg/ml، (ج) پس از ۴۸ ساعت تیمار با MAP 5 mg/ml، (د) پس از ۴۸ ساعت تیمار با CP 5 mg/ml، (ه) پس از ۴۸ ساعت تیمار با MCP 5 mg/ml،

(و) پس از ۴۸ ساعت تیمار با Pectasol 3 mg/ml را نشان می دهد. در این شکلها سلولهایی که در مراحل آپوپتوز اولـیه ( Early apoptotic ( cells هستند توسط پیکانهای سفید ) و سلولهایی که در مراحل آپوپتوز پیشرفته ( ( Late apoptotic cells می باشند توسط پیکانهای خط چین سفید ( نشان داده شده اند. در ضمن ( ) سفید سلولهای نکروزی و ( ) سفید سلولهای طبیعی را نشان می دهند. ( AP=Acid pectic، MAP=Modified Acid Pectic، CP=Citrus Pectin، (MCP=Modified Citrus Pectin

آنالیز آماری: آنالیزهای آماری با استفاده از نرم افزار ۱۳ SPSS و تست پارامتریک ANOVA یک طرفه انجام شده

است.

P ≤ ۰/۰۵ به عنوان اختلاف معنی دار محاسبه شده است و نتایج به صورت ± SEM میانگین (n =3) نشان داده شده است.

نتایج

رنگ آمیزی سلولها با روش گیمسا: به منظور بررسی دقیق تر تغییرات مورفولوژیکی سلولهای DU145 پس از تیمار مشتقات پکتینی، تعداد ۵×۱۰۵ سلول را روی لامل کوچک به قطر ۱ سانتیمتر کشت داده و سپس توسط غلظتهای ۰/۰۱، ۰/۱، ۰/۵، ۱، ۳ و mg/ml 5 از مشتقات پکتینی تیمار شد. پس از گذشت ۴۸ ساعت از تیمار

سلولها، آنها را رنگ آمیزی گیمسا نموده و به وسیله میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفت. مورفولوژی سلولها پس از این مدت در نمونه شاهد کاملاً طبیعی است و سلولها به کف فلاسک چسبیده و کشیده شده اند و برخی از سلولها نیز در حال تقسیم می باشند. غلظتهای مختلف CP تغییر خاصی در مورفولوژی سلولها ایجاد نکردند. در نمونه های با غلظت پایینAP، MAP، MCP، ۰/۰۱) Pectasol، ۰/۱، (mg/ml 0/5 نیز تغییری در مورفولوژی نسبت به سلولهای شاهد مشاهده نگردید. اما سلولهای تحت تیمار با غلظتهای بالای اسید پکتیک، MCP
و ۱ ) Pectasol، ۳ و (mg/ml 5 تغییرات مورفولوژیکی زیر را نشان دادند:

این فقط قسمتی از متن مقاله است . جهت دریافت کل متن مقاله ، لطفا آن را خریداری نمایید
word قابل ویرایش - قیمت 9700 تومان در 14 صفحه
97,000 ریال – خرید و دانلود
سایر مقالات موجود در این موضوع
دیدگاه خود را مطرح فرمایید . وظیفه ماست که به سوالات شما پاسخ دهیم

پاسخ دیدگاه شما ایمیل خواهد شد