بخشی از مقاله
بررسی اثر عصاره مخمر، پپتون، پودر شیر، عصاره مالت در پودر آب پنیر بر روي رشد و جمعیت نهایی
لاکتوباسیلوس بولگاریکوس در شرایط بدون کنترل pH
چکیده
لاکتوباسیلوس دلبروئکی زیر گونه بولگاریکوس (ال. بولگاریکوس ) یکی از دو باکتري کشت آغازگر سنتی ماست و پنیر است. تولید صنعتی کشتهاي آغازگر مورد استفاده در صنایع لبنی یکی از کاربرد هاي بیوتکنولوژي است که می تواند در جهت رفع وابستگی به واردات این گونه محصولات بیانجامد. آب پنیر فراورده جانبی پنیر سازي است که وجود ترکیبات آلی مغذي در آن مثل لاکتوز، پروتئینهاي محلول و پپتید هاي شیر امکان استفاده از آن را براي رشد باکتري هاي لاکتیک فراهم می سازد. با این حال، کیفیت و کمیت مواد ازته آب پنیر براي رشد باکتري هاي لاکتیک بهینه نیست و نیازمند غنی سازي با سایر منابع پروتئنی است. هدف از انجام این مطالعه، بررسی اثر غلظت آب پنیر اولترافیلتر شده و غنی سازي آن با عصاره مخمر، پودر شیر، پپتون و عصاره مالت براي بهینه سازي ترکیب آن جهت رشد یک سویه ال.بولگاریکوس در شرایط ناپیوسته و بدون کنترل pH بود. نتایج نشان داد که غنی سازي آب پنیر با عصاره مخمر موجب افزایش نرخ رشد باکتري و جمعیت نهایی آن می شود . اثر قابل توجه عصاره مخمر در افزایش تعداد باکتري، اثر مثبت سایر عوامل مورد بررسی را تحت تاثیر قرار داده به طوریکه سایر منایع رشد در غلظتهاي مورد استفاده در حضور مخمر اثري در افزایش کارایی محیط نداشته و حتی گاهی برهمکنش منفی از کاکرد آنها با یکدیگر مشاهده شد. مصرف 5 گرم برلیتر عصاره مخمر به تنهایی باعث شد تا جمعیت نهایی باکتري 3/7×108 سلول در هر میلی لیتر افزایش یابد.
کلمات کلیدي: لاکتوباسیلوس بولگاریکوس، آب پنیر، عصاره مخمر، محیط کشت
مقدمه لاکتوباسیلوس بولگاریکوس یکی از مهمترین باکتري هاي آغازگر ماست به شمار می رود. این باکتري جز گروه باکتري هاي همولاکتیک است. باکتري هاي اسید لاکتیک گروهی از کوکسی ها و باسیل هاي گرم مثبت را تشکیل می دهند که متابولیسم آنها در جهت تشکیل مقادیر زیاد اسید لاکتیک می باشد. ال.بولگاریکوس باکتري میکروآئروفیل است که از مسیر امبدن-مرهوف((EMP براي تبدیل لاکتوز به پیروات استفاده می نمایند.لاکتوز توسط آنزیم بتا-گالاکتوزیداز به گالاکتوز و گلوکز تبدیل می شود. اثر pH بر روي فعالیت این آنزیم بررسی شده است[8]، بتا -گالاکتوزیداز داراي فعالیت کمی در pH کمتر از 4 است و در pH حدود 5/5 داراي بهترین کارکرد می باشد. .[1] لاکتوباسیلوس بولگاریکوس جز زیر گونه لاکتوباسیلوس دلبروکی به شمار می آید. سوش هاي این باکتري در کمتر از10 °C رشد کمی دارند و بیشتر سوش ها قادرند در50- 55 °C رشد نمایند.[7] بل و همکارانش[4-2] دما و pH بهینه براي لاکتوباسیلوس بولگاریکوس را به ترتیب 44 °C و 5/8 گزارش کرده اند.
.محیط کشت اختصاصی براي تولید لاکتوباسیل ها دمن-روگوزا-آگار (MRS) محیطی بسیار غنی از پپتون، عصاره مخمر، گلوکز و املاح منگنز و منیزیم است. در پژوهشی که براي ال. بولگاریکوس صورت گرفته از محیط کشت MRS با قند لاکتوز با غلظت متغیر از 20 تا 70 گرم بر لیتر استفاده شده است.[8 ,5]کشت در شرایط بهینه دما و pH صورت گرفته است. نتایج نشان می دهد که با غلظت بیشتر از 40 گرم بر لیتر از لاکتوز نرخ رشد اولیه ال. بولکاریکوس کاهش می یابد، که نشان دهنده بازدارندگی سوبسترا در ابتداي تخمیر است . محیط کشت ام آر اس گرانقیمت بوده و براي تکثیر باکتري مورد بحث در مقیاس صنعتی مناسب نیست. آب پنیر یکی از ضایعات کارخانه هاي لبنی است که داراي میزان قابل توجهی قند به ویژه لاکتوز و استفاده از آن بعنوان پایه محیط کشت براي تکثیر لاکتوباسیل ها مورد توجه قرار گرفته است. بهرحال بدلیل ملزومات متنوع غذائی لاکتوباسیل ها غنی سازي آب پنیر با منابع ویتامین و اسیدهاي آمینه ضروري است کشت باکتري مورد بحث در محیطی حاوي مخلوطی از آب پنیر 60 گرم بر لیتر، لاکتوز 40 گرم بر لیتر، باکتوپپتون و عصاره مخمر هر کدام 5 گرم بر لیتر و آنتی فوم 1 میلی لیتر بر لیتر ، در دما و pH بهینه به 1/8 *109 با کتري در هر میلی لیتر انجامیده است.[4]
تکثیر باکتري مورد بحث در ظروف آزمایشگاهی با کاهش pH در اثر تولید اسید لاکتیک بتدریج کاهش می یابد. در پژوهش حاضر اثر افزودن عصاره مخمر، پودر شیر، پپتون، عصاره مالت و غلظت آب پنیر بر جمعیت نهایی و نرخ رشد یک زیرگونه خالص لاکتوباسیلوس بولگاریکوس جداسازي شده از یک ماست محلی بررسی شده است.
مواد و روش ها لاکتوباسیلوس بولگاریکوس جدا شده از ماست محلی که توسط تست هاي بیوشیمیاي و مورفولوژي کلونی وباکتري در سطح گونه شناسایی شده بود، در این آزمایشات مورد استفاده قرار گرفت. محیط کشت مورد استفاه در این آزمایشات مخلوطی از آب پنیراولترافیلتر شده (تهیه شده از کارخانه پگاه اصفهان)، پپتون(مرك)، پودر شیر(از کارخانه پگاه اصفهان)، عصاره مخمر(مرك) و عصاره مالت(مرك) است. این آزمایشات با مقادیر مختلف از هر یک از منابع ازته انجام شد. آب پنیر%10 از استریل کردن100 گرم بر لیتر پودر آب پنیر در آب در 110 درجه سانتیگراد و به مدت 20 دقیقه به دست آمده است. شیر باز یابی شده از پودر شیر با غلظت 10 گرم در دسی لیتر نیز در 90 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه استریل شد. پپتون و عصاره مالت نیز به صورت 10 گرم در 100 میلی لیتر آب تهیه و در 110 درجه سانتیگراد و به مدت 20 دقیقه استریل شد. عصاره مخمر به صورت 15،10،5 گرم در 100 میلی لیتر آب تهیه و در 110 درجه سانتیگراد و به مدت 30 دقیقه استریل شد.
به دلیلی اینکه به وجود آوردن شرایط با کنترل pH مشکل و نیازمند فرمانتور با کنترل دقیق است، براي برآورد محیط کشت مناسب از کشت درون لوله آزمایش استفاده می شود. هر آزمایش در یک لوله آزمایش50 میلی لیتري با حجم 10 میلی لیتر مایع انجام شد. تلقیح ازال.بولگاریکوس به صورت کشت تازه و به مقدار0/02 میلی لیتر انجام گرفت. سپس لوله هاي آزمایش به صورت شیب دار در انکباتور با% 5 co 2 و دماي 44 درجه سانتیگراد به مدت 18 ساعت قرار داده شد .بعد از 18 ساعت شمارش باکتري ها توسط لام توما به صورت دستی و با نرم افزار[6] انجام شد. در آزمایش هاي اندازه گیري نرخ رشد براي هر محیط 10 لوله منظور شد که هر ساعت یکی از انها شمارش و pH آن نیز اندازه گیري شد. در این سري از آزمایش ها از آب پنیر 5 و 10 در صد و عصاره مخمر، پودر شیر و پپتون در دو سطح 0 و 5 گرم بر لیتراستفاده شد.
طراحی آزمایشات این تحقیق در دو مرحله انجام شد. در مرحله اول با استفاده از طرح فاکتوریل کامل اثر عصاره مخمر در سه سطح از 5 تا 15 گرم بر لیتر و پودر شیر و پپتون و عصاره مالت در دو سطح 0 و5 گرم بر لیتر بررسی شد. طراحی آزمایش در این مرحله شامل 24 آزمایش به صورت فاکتوریل ساده می باشد که با دوبار تکرار در 48 لوله آزمایش انجام شد.(اعداد ذکر نشده اند). در مرحله دوم عوامل رشدي که در مرحله اول تاثیر چندانی در در رشد باکتري نداشتند از مطالعه حذف شده و اثر غلطت آب پنیر در دو سطح 5 و %10 و عصاره مخمر و پودر شیر در دو سطح 0 و 5 گرم بر لیتر بررسی شد. این مرحله شامل 8 آزمایش می باشد که به صورت فاکتوریل کامل انجام گرفت .در این مرحله علاوه بر جمعیت نهایی باکتري نمودار رشد ترسیم و نرخ رشد در هر کدام اندازه گیري شد. در آزمایش هاي مرحله دوم سعی شد با رسم نمودار رشد نرخ رشد ماکزیم نیز اندازه گیري گردد. بنابراین، نمودار رشد هر یک از محیط ها با استفاده از شمارش باکتري ها تا 12 ساعت رسم شد و سپس نرخ رشد ماکزیمم و جمعیت نهایی با هم مقایسه شدند.
بحث و نتیجه گیري نتایج به دست آمده از مرحله اول آزمایشات:
از تحلیل نتایج به دست آمده توسط نرم افزار SAS از جمعیت نهایی ال.بولگاریکوس اثر 4 فاکتور بررسی شده در جدول 1 آمده است.
جدول:1 اثرات براي جمعیت نهایی ال. بولگاریکوس در آب پنیر % 10 و فاکتور هاي عصاره مخمر((YE، پودر شیر((MP، پپتون((PEP، عصاره
