بخشی از مقاله
چکیده
متالوتیونینها پلی پپتیدهایی غنی از سیستئین بوده که توسط خانوادهاي از ژنها کد میشوند. این پروتئینها داراي وزن مولکولی کم - کمتر از 10 کیلو دالتون - و با تمایل زیاد به فلزات میباشند، بنابراین در متابولیسمهاي سلولی فراوانی حائز اهمیت هستند. متالوتیونینهاي گیاهی خانوادهاي از این پروتئینها میباشند که به چهار زیر خانواده مجزا تقسیم می-شوند. مطالعات قبلی تأیید کننده قابلیت اتصال پروتئین نوع P1 متالوتیونینهاي گیاهی به فلزات دو ظرفیتی میباشد، ولی تاکنون قابلیت اتصال هر دومین به صوت جداگانه در این گروه از پروتئینها بررسی نشده است. در این مطالعه به منظور بررسی جداگانه هر دومین، با حذف انتهاي آمینی غنی از سیستئن در ژن OsMTI-Ib، پروتئین نوترکیب C-OsMTI-Ib که حاوي انتهاي کربوکسی میباشد، تولید شد. جهت مطالعه قابلیت اتصال پروتئین نوترکیب تولید شده به یون نیکل در محیط in vitro، بیان هترلوگ فرم نوترکیب C-OsMTI-Ib با استفاده از ناقل بیانی pET41a و در میزبان باکتریایی E.coli سویه Rossetta - DE3 - انجام گرفت. فرم طبیعی OsMTI-Ib نیز به عنوان سویه شاهد، به همراه فرم C-OsMTI-Ib و به وسیله روش کروماتوگرافی تمایلی، خالصسازي شد. مقایسههاي صورت گرفته، توسط ترسیم منحنیهاي رشد و سنجش طیف UV انجام شد. نتایج حاصل نشاندهنده عدم جذب نیکل توسط پروتئین نوع طبیعی، و جذب نسبی این فلز توسط پروتئین نوترکیب میباشد، که میتواند بیانگر استقلال عمل انتهاي کربوکسی در مورد تشکیل خوشههاي تیولی و اتصال به فلز، و همچنین تأثیر فشردگی بیشتر بر پیچش و میانکنشهاي درون پروتئینی، در افزایش نسبی عملکرد این پروتئین باشد.
واژگان کلیدي: متالوتیونین، انتهاي کربوکسی، برنج، نیکل
-1 مقدمه
متالوتونینها1 خانواده بزرگی از متالوپروتئینها میباشند که در ابتدا به عنوان پروتئینهاي متصل شونده به روي، مس و کادمیوم در حیوانات جداسازي شدند. متالوتیونینها پلی پپتیدهایی غنی از سیستئین بوده که توسط خانوادهاي از ژنها کد میشوند. این پروتئینها داراي وزن مولکولی کم - کمتر از 10 کیلو دالتون - و با تمایل زیاد به فلزات میباشند، بنابراین در متابولیسم فلزات نقش مهمی ایفا میکنند - . - Davis and Cousins, 2000
متالوتونینها براساس مشابهت توالی و ارتباط فیزیولوژیکی، در 15 خانواده طبقهبندي میشوند. متالوتیونینهاي گیاهی در خانواده شماره 15 قرار میگیرند که خود براساس حضور اسیدآمینههاي سیستئین در نواحی غنی از سیستئین زنجیره آمینواسیدي و عمدتاً براساس الگوي توزیع سیستئین در دومین آمینی، در چهار زیرخانواده طبقهبندي میشوند: P1، P2، P3 و Pec که به ترتیب به MT1، MT2، MT3 و MT4 اشاره دارند - . - Hassinen et al., 2011 تعداد سیستینها در متالوتونینهاي گیاهی از 45 تا 87 متفاوت میباشد - . - Freisinger, 2009
ویژگی اصلی کلاس یک این خانواده - - MTI که اکثر ژنهاي متالوتونینهاي گیاهی در آن قرار دارند وجود دو ناحیه غنی از سیستئین در دو انتهاي آمینی - α دومین 2 - و کربوکسی - β دومین - 3 پروتئین میباشد - . - Freisinger, 2010 این کلاس بر اساس توریع سیستئین در انتهاي آمینی پروتئین به چهار تیپ مختلف تقسیم می شود. به جز در مواردي نادري معمولا در تیپ یک، در هر کدام از دو انتهاي پروتئین شش آمینواسید سیستئین وجود دارد که نحوه آرایش آنها در انتهاي آمینی به صورت موتیفهاي C-X-C بوده، اما بر خلاف انتهاي آمینی که در تیپهاي مختلف داراي تعداد و الگوي سیستئین متفاوت میباشد، تعداد و الگوي سیستئین ها در انتهاي کربوکسی، در بین تمام تیپها به جز در موارد نادري به صورت CXCXXXCXCXXCXCو کاملاً حفاظت شده می باشد.
هر یون دوظرفیتی مانند کادمیوم، از طریق پیوندهاي مرکاپتیدي و به صورت چهار وجهی با اتمهاي گوگرد چهار اسیدآمینه سیستئین در متالوتیونین اتصال برقرار میکند - . - Domènech et al., 2006 تشکیل پیوندهاي مرکاپتیدي بین دنباله-هاي سیستئین متالوتیونینها و فلز، به آنها قابلیت اتصال به فلزات متنوعی را میدهد. همچنین ترتیب دنبالههاي سیستئین نیز تا اندارهاي تعیین کننده ویژگیهاي اتصال به فلز در آنها میباشد - . - Blindauer and Leszczyszyn, 2010
بررسی عملکرد اتصال به فلزات براي هر کدام از دو انتهاي کربوکسی و آمینو در متالوتیونین پستانداران به صورت جداگانه، در تحقیقات متعددي انجام گرفته است - β . - Kurasaki et al., 1997 دومین متالوتیونین نقش پراهمیتتري نسبت به α دومین در هموستازي غلظت داخل سلولی یونهاي فلزي ضروري در جانداران زنده بازي میکند. بررسی فعالیت انتهاي آمینوي متالوتیونین انسانی نیز نشان دهنده مستقل بودن عملکرد این انتها از انتهاي کربوکسی بوده است. مقایسه قابلیت اتصال به فلز α و β دومین در متالوتیونین نشان میدهد که α دومین اتصال به یونهاي کادمیوم را ترجیح میدهد، در حالی که β دومین اتصال به یونهاي روي را ترجیح میدهد، که ممکن است نشان دهنده فعالیتهاي متفاوت α و β دومین و اختصاصی عمل کردن هر انتها در اتصال به فلزات میباشد - . - Zhou et al ., 2000 همچنین اتصال کادمیوم به αدومین معمولاً پایداري خیلی بیشتري از اتصال آن به β دومین دارد. تفاوت بین α دومین و β دومین اصلی در پروتئین نوع وحشی، با افزودن دنبالههاي سیستئین بیشتر در β دومین، کاهش مییابد - . - Huang et al., 2002
در این تحقیق قصد داریم با حذف انتهاي آمینی غنی از سیستئین یکی ایزوفرمهاي متالوتیونین تیپ یک برنج OsMTI- - - 1b به ایجاد یک پروتئین موتاسیون یافته بدون انتهاي آمینی بپردازیم و سپس با مقایسه پروتئین موتاسیون یافته و پروتئین طبیعی از گیاه برنج توسط منحنیهاي مقاوت به فلز و جذب UV، به بررسی تأثیر این حذف بر عملکرد پروتئین در اتصال به فلز نیکل بپردازیم.
-2 مواد و روشها
ژن کد کننده OsMTI-1bقبلاً به باکتري E.coli انتقال داده و به صورت الحاق یافته به پروتئین GST، به صورت نوترکیب تولید شده بود. براي ایجاد ژن موتاسیون یافته که فاقد منطقه کد کننده انتهاي آمینی غنی از سیستئین باشد، از ژن کاملOsMTI-1bکه قبلاً درناقل pET41a به باکتري E.coli سویه DH5α منتقل شده بود به عنوان ماده اولیه در این تحقیق استفاده شد. در این مطالعه جهت کلونسازي ژن از ناقل کلونینگ Puc57 و میزبان باکتریایی E.coli سویه DH5α استفاد شد. مراحل بیان ژن و تولید پروتئین نیز به کمک ناقل بیانی pET41a و میزبان باکتریایی E.coli سویه Rosetta - DE3 - انجام گرفت.
به منظور حذف انتهاي آمینی، طراحی پرایمر از روي توالی کد کننده ژن به نحوي انجام گرفت که تنها انتهاي کربوکسی و ناحیه اتصال دهنده پروتئین کد شوند. در دو انتهاي پرابمر جایگاه آنزیمهاي برشی EcoRI و HindIII نیز تعبیه شد. واکنش اتصال توسط آنزیم T4 DNA ligase انجام گرفت. سپس محصول حاصل توسط آنزیمهاي مذکور مورد هضم آنزیمی قرار گرفته و قطعه حاصل به ناقل pET41a که از قبل توسط همین آنزیمها برش داده شده بود، انتقال پیدا کرد. صحت انتقال انجام گرفته توسط روشهاي کلونی PCR ،هضم آنزیمی و در نهایت به کمک توالییابی تأیید گردید.
به منظور تأیید بیان پروتئین نوترکیب در میزبان جدید، بیان پروتئین در مقیاس کوچک در محیط کشت LB حاوي آنتیبیوتیکهاي کانامایسین - 50µg/ml - و کلرامفنیکل - - 5µg/ml و توسط القاء کننده IPTG در غلظت نهایی 0,1 میلی مولار انجام گرفت. سپس استخراج پروتئین محلول به روش سونیکیشن انجام و بر روي ژل SDS-PAGE ران شد. مقایسه باند حاصل از پروتئین نوترکیب با پروتئین استخراج شده از باکتري کنترل - حاوي پلاسمید بیانی با ژن کامل - تأیید کننده بیان پروتئین بود. سپس بیان در مقیاس بزرگ به منظور خالصسازي پروتئین نوترکیب انجام گرفت. در مرحله بیان پروتئین، جهت پایداري بیشتر پروتئینهاي نوترکیب تولید شده، یون روي با غلظت نهایی 0/6 میلی مولار به محیط کشت افزوده شد، که طی مراحل خالصسازي پروتئین و تولید فرم آپو - فرم فاقد فلز پروتئین - ، این فلزات اتصال یافته حذف میگردند. به منظور بررسی میزان مقاومت باکتري نوترکیب به فلز نیکل، از غلظت 0/2 میلی مولار آن در محیط کشت استفاده گشت، و سپس منحنیهاي رشد آن ترسیم و با باکتري شاهد مقایسه شد.
خالصسازي پروتئین مورد نظر توسط روش کروماتوگرافی جذبی و با استفاده از ستون کروماتوگرافی نیکل یک میلیلیتري - GE Healthcare - HisTrapTM HP و براساس پروتوکل پیشنهادي شرکت انجام گرفت. لازم به ذکر است که به دلیل حساسیت پروتئین، کلیه مراحل استخراج و خالصسازي بر روي یخ و در دماي 4c انجام گرفت. پس از خالصسازي غلظت پروتئین حاصل با استفاده از قانون بیر- لمبرت محاسبه گردید.
جهت سنجش قابلیت اتصال پروتئین موتاسیون یافته و پروتئین طبیعی به فلز نیکل، بجاي افزودن فلز به محیط کشت، که براي سلولهاي میزبان سمی بوده و ممکن است بیان پروتئین را دچار نقصان سازد، در معرض فلز 10 - برابر غلظت پروتئین - قرار دادن پروتئین پس از خالصسازي پروتئین و تولید فرم آپوي آن انجام گرفت. به منظور حذف فلزات اتصال نیافته
