بخشی از مقاله
چکیده:
فلزات سنگین مانند آهن ونیکل از عناصر ضروري میکرو براي رشد گیاهان محسوب می شوند با این حال در غلظت هاي زیاد سمی می باشند . از دلایل سمیت نیکل در گیاهان تأثیر آن برهوموستازي آهن در ریشه واندامهاي هوایی با مکانیسم هاي متفاوت است وتأثیرفلزات سنگین بر استرس اکسید اتیو باتوجه به فعالیت انزیم هاي انتی اکسیدانت شناخته شده است. در این بررسی گیاه بیش انباشتگر نیکل Alyssum inflatum در محیط هیدروپونیک، تحت تیمارهاي با غلظت هاي مختلف آهن ونیکل قرار گرفته وفعالیت آنزیم هاي آنتی اکسیدان حاوي آهن کاتالاز - CAT - و آسکوربات پراکسیداز - APX - در ریشه وبخش هوایی این گیاه بررسی شد. نتایج نشان داد که فعالیت این دو آنزیم در بخش هوایی جوان در حضور مقادیر سمی نیکل به طور معنا داري کاهش می یابد ولی در بخش هوایی مسن تر حضور مقادیر کم و سمی نیکل کاهش معنا داري را موجب نمی شود. در ریشه فعالیت این دو آنزیم حتی در حضور مقادیر بسیار زیاد نیکل افزایش می یابد. بنابراین نیکل بر فعالیت آنزیم هاي آنتی اکسیدانت - کاتالازوآسکوربات پراکسید از - تأثیر می گذارد. این اثر با توجه به برهمکنش نیکل و آهن در جذب . انتقال در گیاه، می تواند به دلیل تاثیر نیکل بر هوموستازي آهن باشد.
مقدمه:
برخی از خاکها به طور طبیعی غنی از فلزات سنگین هستند وبهترین مثال براي چنین خاکهایی، خاکهاي سرپنتین غنی از آهن، نیکل، کروم و کبالت می باشد. . - Brooks,1987 - این خاکها خصوصیات خاصی دارند از جمله اینکه داراي درجه بالایی از اندمیسم گیاهی می باشند که به خوبی با شرایط نامساعد محیط سازش پیدا کرده اند. گیاهان داراي سیستم هاي دفاعی براي سم زدایی رادیکالهاي اکسیژن وپراکسیدهیدروژن می باشند. چنین قابلیتی در گیاهان سرپنتین با درجات بالایی دیده می شود . - Boominathan and Doran, 2002 - زدودن انواع فعال اکسیژن - ROS - تولید شده در سلولها توسط چندین آنزیم در مسیرها وچرخه هاي متابولیکی مختلف انجام می شود . - Ahmad,1995 - آنزیم CAT باغلظت زیاد در اجسام زیر درون سلولی شامل پراکسی زوم ها وگلی اکسی زوم ها وسایر اندامک ها وجود دارد وسرعت انجام واکنش در آن سریع وجزء آنزیم هاي سریع محسوب می شود . - Aebi,1984 - آنزیم APX نیز یک آنزیم حاوي آهن است ویک هموپروتئین محسوب می شود و فقط در گیاهان وجود دارد . - Ahmad,1995 - جذب زیاد آهن موجب افزایش بیان ژنهاي APX و CAT سیتوزولی در بخش هاي هوایی گیاه می شود ودر شرایط کمبود آهن فعالیت آنزیم CAT و APXکاهش می یابد . - Fourcroy et al., 2004; Ghasemi et al., 2009 - برخی از گیاهان توانایی انباشت مقادیر زیادي از فلزات سنگین را در اندام هاي هوایی خود دارند که به این گیاهان بیش انباشتگر فلز گفته می شود. توانایی انباشت فلزات نیازمند کسب خصوصیاتی از جمله قدرت بالا براي مقابله با تولید رادیکال هاي آزاد است. در هر حال براي این گیاهان نیز در صورتی که از حد توانایی گیاهان غلظت فلز افزایش یابد، اثرات سمی نمایان می شود. گیاه Alyssum inflatum بومی خاك هاي سرپنتین غرب ایران است. مطالعات قبلی انجام شده بر روي این گیاه حاکی از قدرت بیش انباشت نیکل در این گیاه است. بررسی مقاومت این گیاه به غلظت هاي مختلف نیکل نشان داده است که غلظت هاي تا 350 میکرومولار برایاین گیاه قابل تحمل است و در غلظت هاي بالاتر آثار سمیت را نشان می دهد
براین اساس هدف این مطالعه به منظور پاسخ به سؤال زیر انجام گرفته است :
آیا حضور مقادیر سمی نیکل می تواند بر فعالیت دو آنزیم CAT وAPX در گیاه انباشتگر Alyssm inflatum تأثیربگذارد و آیا این تاثیر در بخش هاي مختلف گیاه یکسان خواهد بود؟
مواد و روشها
دانه هاي گیاه انباشتگر و Alyssm inflatum پس از برداشت از زیستگاههاي طبیعی وگذراندن دوره سرما به مدت سه ماه، بر روي پرلیت در شرایط گلخانه کاشته شدند وبا محلول غذایی هوگلند تغییر یافته حاوي ترکیبات نیترات کلسیم ، نیترات پتاسیم وسولفات منیزیم - هر سه ترکیب با غلظت %5 میلی مولار - و فسفات دي هیدروژن پتاسیم 0/1 میلی مولار وعناصر میکرو شامل اسید بوریک 10 میکرومولار، سولفات منگنز 2 میکرومولار، سولفات روي 0/2 میکرومولار، سولفات مس 0/2 میکرومولار ، کلریدسدیم 2 میکرومولار، مولیبدات سدیم 0/1 میکرو مولار و 5 FeEDDHA میکرو مولار به مدت یک ماه تغذیه شدند . وقتی جفت برگی دوم گیاه رشد کرد به محیط هیدروپونیک منتقل شده ودر محیط هیدروپونیک به مدت یک ماه با همان محلول غذایی هوگلند تغییر یافته تغذیه شده وسپس تیمار گیاه انباشتگر Alyssm inflatum با غلظت هاي مختلف NiSO4 و Fe EDDHA انجام شد. غلظت آهن مورد استفاده 5 میکرومولار ونیکل مورد استفاده 0 و100 ،250 و400 میکرو مولار بود . محیط پایه مورد استفاده محلول غذایی هوگلند تغییر یافته بود . براي تعیین فعالیت آنزیم هايCAT و APX، ریشه و بخش هاي هوایی گیاهان رشد یافته در کشت هیدروپونیک با بافر 50 میلی مولار تریس-Cl با 6/8 PH با حجم 4 میلی لیتر ساییده وبه لوله هایی که روي یخ قرار داشته منتقل شدند ولوله ها به مدت 30ثانیه ورتکس شده ومجدداً روي یخ قرار داده شده وپس از آن نمونه ها به مدت 10 دقیقه در دماي 4 درجه سانتی گراد با شدت 4000 g سانتریفیوژ شده ومحلول رویی جهت اندازه گیري فعالیت آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت آنزیمی برحسب میزان پروتئین کل موجود در نمونه ها بیان شد. جهت اندازه گیري پروتئین کل موجود در نمونه ها از روش ارائه شده توسط - 1976 - Bradford استفاده شد.
فعالیت آنزیم هايCAT و APX نیز با استفاده از پروتئین استخراج شدة مذکور اندازه گیري شد. اندازه گیري فعالیتCAT با روش اسپکتوفوتومتري در طول موجUV انجام شد . - Aebi,1983 - محلول واکنش اندازه گیري فعالیت CAT بافر فسفات 50 میلی مولارK2HPO4/KH2PO4 با pH 7 حاوي غلظت 5 میلی مولار H2O2 بود . واکنش با افزودن 200 میکرولیتر محلول حاوي پروتئین به 1800 میکرولیتر محلول واکنش شروع می شد. میزان کاهش جذب در طول زمان در طول موج 240 نانومتر اندازه گیري شد ومیزان فعالیت کاتالاز با استفاده از ضریب جذب H2O2 که برابر0/039 mM-1cm-1 است وهمچنین با توجه به میزان پروتئین اندازه گیري شده در هر نمونه محاسبه شد. اندزه گیري فعالیت APX براساس روش - 2002 - Boominathan and Doran - 1981 - Nakano and Asada انجام شد. محلول واکنش حاوي 725 میکرو لیتر بافرفسفات پتاسیم با PH7 بود که حاوي 0/2 میلی مولارEDTA و 175 میکرو لیتر آسکوربیک اسید 0/5 میلی مولار بود . به این محلول واکنش مقدار 50 میکرولیتر نمونه پروتئین استخراج شده افزوده شد . واکنش با افزودن 50 میکرو لیتر200 H2O2 میلی مولار شروع می شد . کاهش جذب در 290 نانومتر اندازه گیري شد وفعالیت آنزیمی با استفاده از ضریب جذب آسکوربیک اسید که برابر2/6 mM-1cm-1 است و همچنین مقدار پروتئین موجود در هر نمونه محاسبه شد . یک واحد آسکوربات پراکسیداز معادل مقدار آنزیمی است که بتواند یک میکرو مول آسکوربیک اسید را درمدت 1 دقیقه و در دماي 25 درجه سانتیگراد اکسید نماید. در شرایط عدم نمونه پروتئین در محلول واکنش، مقدار کاهش جذب بسیار کم بود. آنالیز آماري داده ها با استفاده از روش آماري one-way Anovaوآزمون Tukey HSD با استفاده از نرم SPSS انجام شد.
نتایج
اندازه گیري فعالیت دو آنزیم آنتی اکسیدانت CAT و APX که در ساختمان خود حاوي یک یا چند اتم آهن هستند نشان داد که فعالیت این آنزیم ها در حضور نیکل می تواند کاهش پیدا کند. در گیاه انباشتگر Alyssum inflatum نشان داده شد که در غلظت زیاد نیکل در محیط کشت 400 - میکرومولار - کاهش معنا داري در فعالیت آنزیم هاي CAT و APX در بخش هوایی جوان رخ می دهد و در بخش هوایی مسن تر در حضور غلظت هاي بالاي نیکل 400 - میکرومولار - فعالیت این دو آنزیم نسبت به غلظت هاي کم نیکل تغییر ندارد. در غلظت 100و250 میکرومولارنیکل تغییر در فعالیت این دو انزیم در بخش هوایی و ریشه مشاهده نشد که از نظر آماري معنی دار نبود. فعالیت این دو آنزیم در ریشه گیاه انباشتگر در حضور غلظت هاي بالاي نیکل افزایش می یابد - شکل هاي 1، . - 2 در غلظت هاي 0، 100 و250 میکرومولار نیکل در محیط، میزان فعالیت آنزیم CAT در بخش هاي هوایی بیش از ریشه گیاه اندازه گیري شد. در غلظت 400 میکرومولار نیکل تفاوت بین ریشه و بخش هاي هوایی معنی دار نبود. فعالیت آنزیم APX در قسمت هاي جوان اندام هاي هوایی بیش از بخش هاي مسن تر گیاه تعین شد ولی تفاوتی بین بخش هاي مسن تر اندام هاي هوایی و ریشه مشاهده نشد - شکل . - 2
