بخشی از مقاله
چکیده
سنبلالطیب یک گیاه دارویی مهم است که بهدلیل اثر آرامبخشی خفیف بهطور گستردهاي مورد استفاده قرار میگیرد. ریشههاي موئین بهلحاظ رشد سریع و پایداري ژنتیکی بالا از اهمیت زیادي در تولید درون شیشهاي متابولیت ثانویه با ارزش برخوردار هستند.
در این تحقیق تاثیر امواج فراصوت بر رشد کشتهاي ریشه موئین سنبلالطیب و تولید متابولیتهاي ثانویه مورد بررسی قرار گرفت. براي این منظور، ریشههاي موئین با امواج فراصوت صفر - شاهد - ، 20 و 30 ثانیه تیمار شده و در زمانهاي مختلف، رشد - وزن خشک - ریشهها، فعالیت آنزیمهاي کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز، میزان پراکسید هیدروژن و والرنیک اسید در آنها مورد اندازهگیري قرار گرفت.
نتایج نشان داد که تیمار امواج فراصوت باعث کاهش رشد ریشهها شده است. برعکس، امواج فراصوت 20 ثانیه باعث افزایش معنیدار میزان والرنیک اسید در ریشههاي موئین نسبت به تیمار شاهد گردید. تیمار امواج فراصوت باعث افزایش معنیدار میزان میزان پراکسید هیدروژن و فعالیت آنزیمهاي پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز در ریشههاي موئین گردید، ولی از نظر فعالیت آنزیم کاتالاز اختلاف معنیداري وجود نداشت. آنزیم پراکسیداز در زمان 96 ساعت و سوپراکسید دیسموتاز در زمانهاي 12 و 48 و 96 ساعت پس از اعمال تیمار بیشترین فعالیت را داشتند که به طور معنیداري بیشتر ار تیمار شاهد بود.
مقدمه
گیاهان دارویی منبع طیف وسیعی از متابولیتهاي ثانویه میباشند که این متابولیتها را براي اهداف خاص از جمله دفاع در برابر بیمارگرها و شکارچیان، حفاظت از آسیب نور UV و جذب حشرات گردهافشان و غیره تولید میکنند. گیاه والرین - سنبلالطیب - 1 بومی اروپا و آسیا یک گیاه دارویی مهم است که بهدلیل اثر آرامبخشی خفیف بهطور گستردهاي مورد استفاده قرار میگیرد . بهعلت برداشت بیش از حد ریشههاي این گیاه دارویی با ارزش، امروزه بقاء این گیاه در رویشگاههاي طبیعی در معرض خطر قرار گرفته است.
توسعه کشت بافتهاي گیاهی تغییر ژنتیکی داده شده و کشت ریشههاي تراریخته - ریشه موئین - 2 بهوسیله Agrobacterium rhizogenes گام مهمی در استفاده از کشت درون شیشهاي براي تولید متابولیت ثانویه میباشند. ریشههاي موئین بهلحاظ رشد سریع، پایداري ژنتیکی بالا و رشد در محیط عاري از هورمون از اهمیت زیادي برخوردار هستند
محركها پیامهایی هستند که سبب تحریک تولید متابولیتهاي ثانویه میشوند. محركهاي متعددي براي تحریک تولید متابولیتهاي ثانویه در ریشههاي موئین بهکار برده شدهاند که بهطور کلی سبب کاهش زمان فرآیند دستیابی به میزان غلظت بالاي متابولیتها میشوند. ازجمله این محركها امواج فراصوت است که میتواند خروج فرآوردههاي درون سلولی نظیر متابولیتهاي ثانویه دارویی را از سلولهاي گیاهی کشتشده افزایش دهد . - 4 - در این تحقیق تاثیر محرك امواج فراصوت بر رشد ریشههاي موئین، میزان فعالیت آنزیمهاي کاتالاز، پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و میزان پراکسید هیدروژن و همچنین تولید متابولیت ثانویه، مورد بررسی قرار گرفته است.
مواد و روشها
ابتدا ریشههاي موئین با استفاده از ریزنمونه دمبرگ و سویهي Agrobacterium rhizogenes A4 القاء شد و پس از اینکه ریشهها به اندازه دو سانتیمتر رشد کردند، به شیشههاي حاوي 50 میلیلیتر محیط کشت MS مایع و 300 mg/l سفوتاکسیم منتقل شدند. نگهداري کشتها روي شیکر با 120 دور در دقیقه در دماي 24 ± 2 درجه سانتی گراد انجام گرفت. پس از تکثیر ریشههاي موئین، در روز پانزدهم بعد از زیرکشت، امواج فراصوت صفر، 20 و 30 ثانیه بر این کشتها اعمال گردید.
سپس در دورههاي زمانی 12، 24و 48 ساعت و چهار روز پس از اعمال تیمارهاي فوق، ریشههاي موئین برداشت شده و وزن خشک ریشهها، فعالیت آنزیمهاي کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز و میزان پراکسید هیدروژن - 3 - و متابولیت ثانویه والرنیک اسید اندازهگیري شد. اندازهگیري والرنیک اسید با استفاده از دستگاه HPLC انجام گرفت. تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS16 و SAS9.1 صورت گرفت.
نتایج و بحث
تجزیه واریانس دادهها نشان داد که وزن خشک ریشههاي موئین، فعالیت آنزیم پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز و میزان متابولیت ثانویه والرنیک اسید بهطور معنیداري تحت تاثیر امواج فراصوت قرار گرفت. همچنین شاخصهاي وزن خشک ریشههاي موئین و فعالیت آنزیم پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز و میزان پراکسید هیدروژن و والرنیک اسید بهطور معنی داري تحت تاثیر زمان هاي پس از اعمال تیمار قرار گرفتند. میزان رشد سلولها در تیمار امواج فراصوت 20 و 30 ثانیه نسبت به شاهد مربوطه کاهش معنیداري نشان داد. در تیمار سلولهاي Panax ginseng با امواج فراصوت نیز، رشد سلولهاي گیاهی نسبت به شاهد کاهش داشته است .
شکل مربوط به فعالیت آنزیم پراکسیداز بیان کننده آن است که میزان فعالیت آنزیم در دورهي زمانی 4 روز پس از اعمال تیمار بیشترین مقدار را به خود اختصاص داده است - شکل - 2 الف - . علت افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز را می توان به دلیل اعمال تیمار و تحریک شدن سیستمهاي آنتی اکسیدانی و تولید ترکیبات مخرب مانند انواع ROSها دانست.
فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در زمانهاي مختلف پس از اعمال تیمار به طور معنیداري بیشتر از تیمار شاهد بوده و فقط در زمان 24 ساعت پس از اعمال تیمار نسبت به شاهد کاهش نشان داد - شکل -2 ب - . در زمانهاي 24 ساعت و 4 روز پس از اعمال تیمار، میزان پراکسید هیدروژن - H2O2 - نسبت به شاهد کاهش داشت، به طوريکه، بیشترین میزان پراکسید هیدروژن در زمان 24 ساعت در تیمار شاهد مشاهده شد، در حالیکه در زمانهاي 12و 48 ساعت میزان پراکسید هیدروژن نسبت به شاهد افزایش معنیداري نشان دادند - شکل 2 پ - .
وانگ و همکاران - 2006 - گزارش کردند که تیمار سلولهايTaxus yunnanensis با امواج فراصوت باعث افزایش تولید پراکسید هیدروژن میگردد. از آنجا که نوعی اختلال یا تغییر فیزیکی در دیواره یا غشاي پلاسمایی نظیر تخریب، شکاف یا تغییر شکل بر اثر برخورد امواج فراصوت به سطح سلول به وجود میآید، و در نتیجه باعث القاي واکنشهاي دفاعی گیاه میشود.
شکل-1 تاثیر امواج فراصوت بر وزن خشک ریشههاي مویین سنبلالطیب در زمانهاي 12، 24 و 48 ساعت و 4 روز پس از اعمال تیمار. میانگینهاي داراي حروف مشترك، براساس آزمون دانکن در سطح احتمال %5 اختلاف معنیداري با یکدیگر ندارند.
شکل-2 تاثیر تیمار امواج فراصوت بر الف - زمانهاي مختلف پس از اعمال تیمار بر فعالیت آنزیم پراکسیداز، ب - میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و پ - میزان پراکسید هیدروژن در ریشههاي موئین سنبلالطیب در زمانهاي 12، 24، 48 ساعت و 4 روز پس از اعمال تیمار. میانگینهاي داراي حروف مشترك، براساس آزمون دانکن در سطح احتمال %5 اختلاف معنیداري با یکدیگر ندارند.
بیشترین میزان تولید والرنیک اسید با اعمال تیمار امواج فراصوت 20 و 30 ثانیه در زمان 12 ساعت پس از اعمال تیمار به دست آمد، به طوريکه میزان والرنیک اسید در تیمار امواج فراصوت 20 ثانیه 3/55 برابر و در تیمار امواج فراصوت 30 ثانیه 2/82 برابر تیمار شاهد بود - شکل . - 3 تیمار سلولهاي گیاهی با محركهاي غیر زیستی مانند امواج فراصوت همواره یکی از موثرترین ابزارهاي تحریک سنتز متابولیتهاي ثانویه میباشد.
