بخشی از مقاله
چکیده
سنبلالطیب یکی از گیاهان مهم خانواده valerianacea است که برای درمان بیخوابی و معالجه بینظمیهای روانی و عصبی موثر است. ریشههای مویین دارای پایداری ژنتیکی و بیوسنتزی هستند و یکی از راهکارهای مهم برای افزایش تولید متابولیتهای ثانویه با ارزش میباشند. در این تحقیق تاثیر متیل جاسمونات 100 - و 200 میکرومولار - و اسید امینه لوسین 1 - و 2 میلی مولار - بر تولید متابولیت ثانویه والرنیک اسید در کشتهای ریشه مویین سنبلالطیب مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که تیمارهای مورد مطالعه در این آزمایش عکس العملهای متفاوتی در زمانهای مختلف نشان دادند. بیشترین میزان تولید والرنیک اسید با اعمال ترکیب تیماری 1 میلی مولار لوسین و 100میکرو مولار متیل جاسمونات در 24 ساعت پس از اعمال تیمار به دست آمد. کمترین میزان والرنیک اسید متعلق به تیمار لوسین 2 میلیمولار در زمان4 روز پس از اعمال تیمار بود.
مقدمه
هزاران سال است که گیاهان از مهمترین منابع درمانی محسوب میشوند. تقریبا یک چهارم داروهای تولید شده حاوی ترکیباتی هستند که از مواد گیاهی به دست آمدهاند یا بر اساس ترکیبات گیاهی مدلسازی شدهاند . - 9 - سنبلالطیب یکی از گیاهان دارویی و عضو مهمی از خانواده valerianacea است که برای درمان بیخوابی استفاده میشود . - 3 - والرین ترکیبی است که از این گیاه به دست آمده و اثبات شده که میتواند برای معالجه بینظمیهای روانی و عصبی موثر باشد . - 4 - کشت سلولی و کشت اندام - جوانه، جنین، ریشه، ریشههای مویین - از جمله روشهای بیوتکنولوژی میباشد که به منظور افزایش تولید متابولیت ثانویه مورد استفاده قرار میگیرند . - 6 - کشت ریشه مویین دارای ویژگیهایی چون سرعت رشد بالا ، عدم نیاز به هورمونهای گیاهی برای رشد، پایداری ژنتیکی و بیوسنتزی و تولید بیشتر متابولیت ثانویه نسبت به سایر روشهای کشت بافت میباشند که علاوه بر افزایش تولید متابولیت ثانویه میتواند برای بررسی مداخله کنندهها و آنزیمهای کلیدی درگیر در بیوسنتز متابولیت ثانویه نیز مورد استفاده قرار گیرد . - 7 - محرکها مولکولهایی هستند که باعث القا و تحریک سلولهای گیاهی برای تولید متابولیتها میشوند. این ترکیبات شامل آنزیمهای تجزیه کنندهی دیوارهی سلولی یا بخشهایی از دیوارهی سلولی میکروارگانیسمها مانند گلوکان میباشد. همچنین از برخی مواد شیمیایی - متیل جاسمونات - میتوان به عنوان محرک استفاده نمود . - 2 - در این تحقیق اثر متیل جاسمونات به عنوان محرک و و آسید امینه لوسین به عنوان پیش ماده بر تولید متابولیت ثانویه والرنیک اسید در ریشههای مویین، مورد بررسی قرار گرفته است.
مواد و روش
بذور سنبل الطیب گونه valeriana officinalis از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه گردید، بذور پس از ضدعفونی سطحی توسط الکل %70 به مدت 30 ثانیه و محلول هیپوکلریت سدیم به مدت 12دقیقه، روی محیط MS فاقد تنظیمکنندههای رشد کشت شده و در اتاقک رشد با شرایط دمایی 25 2 درجه سانتیگراد با دورهی نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. پس از جوانهزنی بذور و رشد گیاهچهها، بخشهای برگ و دمبرگ گیاه به عنوان ریزنمونه در شرایط استریل انتخاب و با سوسپانسیون آگروباکتریوم رایزوژنز سویه A4 تلقیح شدند. ریزنمونههای تلقیح شده پس از حذف باکتریهای اضافی، روی محیط MS فاقد تنظیمکنندههای رشدی کشت شدند. سپس ریزنمونهها روی محیط MS مایع حاوی300 mg/l آنتیبیوتیک سفوتاکسیم منتقل شدند.ریشههای موئین تولید شده نگهداری کشتها روی شیکر با 120 دور در دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد انجام گرفت و این کشتها هر 20 روز یک بار واکشت شدند. پس از بررسی تراریختگی ریشههای موئین از طریق PCR، ریشههای موئین تراریخته تکثیر شده، در روز پانزدهم بعد از واکشتی، غلظتهای 100 و 200 میکرومولار متیل جاسمونات، 1و2 میلی مولار لوسین و ترکیب آنها بر این کشتها اعمال گردید. 24 ساعت و چهار روز پس از اعمال تیمارهای فوق ریشه های موئین برداشت شد. و متابولیت ثانویه والرنیک اسید اندازهگیری شد. اندازهگیری والرنیک اسید با استفاده از دستگاه HPLC انجام گرفت. از والرنیک اسید به عنوان استاندارد برای کمیسازی دادهها استفاده شد. تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS23 صورت گرفت.
نتایج و بحث
تجزیه واریانس دادهها - جدول - 1 نشان داد که اثر متقابل تیمار در زمان در سطح احتمال 1 درصد معنیدار شد این نشان دهنده این موضوع است که تیمارهای مورد مطالعه در این آزمایش عکس العملهای متفاوتی در زمانهای مختلف نشان دادند. در واقع میزان متابولیت ثانویه والرنیک اسید به طور معنیداری تحت تأثیر محرکهای متیل جاسمونات و اسید امینه لوسین و در زمانهای مختلف پس از اعمال تیمار قرار گرفت. بدین منظور مقایسه میانگین بر اساس آزمون دانکن انجام شد تا تفاوت معنیدار بین ترکیبهای تیماری مورد مطالعه در این آزمایش مورد بررسی قرار گیرد. با توجه به جدول مقایسه میانگین - جدول - 2 بیشترین میزان تولید والرنیک اسید با اعمال ترکیب تیماری 1 میلیمولار لوسین و 100میکرو مولار متیل جاسمونات در زمان 24 ساعت پس از اعمال تیمار به دست آمد. به طوری که میزان والرنیک اسید در تیمار ترکیبی فوق و در زمان 24 ساعت پس از اعمال تیمار 4/91 برابر بیشتر از مقدار والرنیک اسید تیمار شاهد بود. کمترین میزان والرنیک اسید متعلق به تیمار لوسین 2 میلیمولار در زمان4 روز پس از اعمال تیمار بود با این حال این میزان از والرنیک اسید هیچ اختلاف معنیداری با غلظت 1 میلیمولار لوسین در هر دو زمان مورد مطالعه و متیل جاسمونات 200 میکرومولار در زمان 4 روز پس از اعمال تیمار و شاهد در هر دو زمان نداشت تیمار ترکیبی متیل جاسمونات 100 میکرومولار و لوسین 2 میلی مولار و تیمار ترکیبی متیل جاسمونات 100 میکرومولار و لوسین 1 میلیمولار در زمان 4روز پس ازاعمال تیمار با تیمار لوسین 2 میلیمولار در زمان 24 ساعت پس از اعمال تیمار هیچ اختلاف معنیداری نداشت. اضافه کردن پیشسازها به محیط به منظور هدایت جریان متابولیک به سمت تولید بیشتر محصولات مورد نظر رویکرد جالبی برای بهبود بهره برداری بالقوه از آنزیمهای موجود در کشت سلولی گیاهان است. در مطالعه ای برای تولید تاکسول توسط گیاه سرخدار فنیلآلانین و لوسین به عنوان بهترین پیشساز گزارش شده است .[8] در آزمایش دیگری نیز بیان شده که تیمار متیل جاسمونات میتواند سطح رونوشت ژن VOTPS1 که در مسیر بیوسنتز والرنیک اسید نقش دارد، در بافت ریشه سنبلالطیب به میزان قابل توجهی افزایش دهد، به طوری که میزان mRNA این ژن در روز اول بعد از اعمال تیمار 4 برابر نسبت به گیاهان شاهد افزایش داشت.
