بخشی از مقاله
چکیده
گونه هاي بنگدانه - هیوسیاموس - از جمله بذرالبنج مشبک - Hyoscyamus reticulatus L. - منابع غنی آلکالوئیدهاي تروپانی، عمدتاً هیوسیامین و اسکوپولامین میباشند که به دلیل اثرات آنتی کولینرژیک، به طور گستردهاي در پزشکی مورد استفاده قرار میگیرند. در این پژوهش تأثیر عصاره مخمر بر میزان رشد و فعالیت آنتی اکسیدانی ریشههاي موئین بذرالبنج مشبک در غلظتها و زمانهاي مختلف تیمار مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد، تیمار با غلظتهاي مختلف عصاره مخمر و نیز افزایش مدت زمان تیمار منجر به کاهش معنی دار وزن تر ریشههاي موئین در مقایسه با کشتهاي شاهد گردید. همچنین میزان فعالیت آنتی اکسیدانی کل در سطح احتمال 1 درصد، به طور معنی داري تحت تأثیر غلظت و زمان تیمار قرار گرفته است. بر اساس نتایج، چنین استنباط میشود که تهییج با عصاره مخمر، منجر به القاء تنش اکسیداتیو گردیده است.
مقدمه
با توجه به این که ریشهها جایگاه اصلی بیوسنتز آلکالوئیدهاي تروپانی هستندو همچنین با توجه به جايگیري اختصاصی بعضی از آنزیمهاي کلیدي درگیر در مسیر بیوسنتز این آلکالوئیدها در ریشه، تلاش براي تولید تروپان آلکالوئیدها در سیستمهاي بیوتکنولوژیک عمدتاً مبتنی بر کشت ریشههاي موئین میباشد . - Palazón et al., 2008 - تولید متابولیتهاي ثانویه با استفاده از این تکنیک هنوز هم دچار محدودیتهایی است. یکی از این موارد، درصد پایین متابولیتهاي تولید شده میباشد. بنابراین رویکردهاي متعددي در این زمینه، مانند استفاده از محركهاي متفاوت و تحریک مسیر بیوسنتزي براي افزایش تولید متابولیتها در کشت ریشههاي موئین اتخاذ شده است. عصاره مخمر به عنوان یک محرك زیستی شناخته میشود که به دلیل تنظیم بالقوه ي متابولیسم ثانویه، در کشت بافت و سلول گیاهان به طور گستردهاي مورد استفاده قرار می گیرد . - Shi et al., 2007 - تمام محركها میتوانند با ایجاد فشار اسمزي به عنوان عوامل تنشی عمل کنند که باعث فعال سازي سریع آنزیمهاي کلیدي در مسیرهاي بیوسنتزي متابولیتهاي ثانویه میشوند . - Gagnon and Ibrahim, 1997 - یکی از پاسخهاي مهم در برابر محركهاي زیستی و غیر زیستی توسط سلولهاي گیاهی، تولید گونههاي فعال اکسیژن میباشد.گیاهان به وسیلهي سیستمهاي آنتی اکسیدانی، گونههاي فعال اکسیژن را کنترل کرده و از این طریق اثرات مخرب آنها را کاهش میدهند . - Vranova et al., 2002 - این پژوهش با هدف بررسی تأثیر عصاره مخمر در غلظتها و زمانهاي مختلف تیمار بر میزان رشد و فعالیت آنتی اکسیدانی کل در کشت ریشههاي موئین بذرالبنج مشبک انجام گرفت.پ
مواد و روشها
بذرهاي گیاه بذرالبنج مشبک از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه و پس از رفع خواب فیزیولوژیکی بذور با استفاده از جیبرلین 250 میلیگرم در لیتر، کشت بذرها در محیط کشت MS صورت گرفت. به منظور تلقیح ریزنمونههاي گیاهی از سویه A7 Agrobacterium rhizogenes، استفاده گردید و کوتیلدونهاي یک هفتهاي، به مدت 3 دقیقه درون سوسپانسیون باکتریایی تهیه شده غوطهور شدند. 2 هفته پس از تلقیح، به تدریج ریشههاي موئین ظاهر و بعد از گذشت یک هفته، هر یک از ریزنمونههاي ریشهدار بهصورت لاینهايمجزا به پتريهاي جداگانه منتقلشدند. واکشت ریزنمونهها در محیط جدیدهر10روز یکبار صورت گرفت. محیط کشتهاي حاوي عصاره مخمر در غلظتهاي صفر، 125، 250، 500 و 1000 میلیگرم در لیتر تهیه گردید. تیمار ریشههاي موئین به مدت 24، 48 و 72ساعت و در 3 تکرار انجام گرفت. پس از گذشتاینمدتزمان،ریشههاي موئین ازمحیط کشت MS حاوي سطوح مختلف محرك خارج و به محیط کشت MS مایع عاري از محرك جهت رشد و تولید متابولیتهاي ثانویه انتقال یافتند. پس از گذشت یک هفته، ریشههاي موئین برداشتو وزن تر و خشکو میزان فعالیت آنتی اکسیدانی کل آنها با استفاده از DPPH و به روش Chiuo و همکاران - 2007 - اندازهگیري گردید. دادههاي حاصل از آزمایش با استفاده از نرم افزار SAS 9.1 مورد تجزیه وتحلیلقرار گرفت و مقایسات میانگین توسط آزمونچند دامنهايدانکن صورت گرفت.
نتایج و بحث
نتایج مقایسه میانگین اثرات اصلی و اثر متقابل غلظت و زمان تیمار با محرك عصاره مخمر نشان داد که اثر اصلی سطوح مختلف غلظت و زمان تیمار به ترتیب در سطح احتمال 1 و 5 درصد، تأثیر معنیداري بر وزن تر ریشههاي موئین بذرالبنج مشبک داشت - جدول . - 1 نتایج نشان داد، تیمار با غلظتهاي مختلف عصاره مخمر منجر به کاهش معنی دار وزن تر ریشههاي موئین در مقایسه با کشتهاي شاهد گردید. به طوري که کمترین میزان وزن تر 6/59 - گرم - ریشههاي موئین در مقایسه با شاهد 9/25 - گرم - تحت تأثیر تیمار با غلظت 250 میلیگرم در لیتر محرك به دست آمد - نمودار . - 1 مقایسات میانگین اثر اصلی زمانهاي مختلف تیمار بر وزن تر ریشههاي موئین نشان داد که بیشترین 8/16 - گرم - و کمترین 6/85 - گرم - وزن تر به ترتیب در زمان 24 و 72 ساعت تیمار با عصاره مخمر مشاهده گردید - نمودار . - 2 طبق نتایج به دست آمده سطوح مختلف غلظت و زمان تیمار با عصاره مخمر تأثیر معنیداري بر میزان وزن خشک ریشههاي موئین تیمار شده نداشت . - P<0.01 - با این حال، حداکثر وزن خشک 0/52 - گرم - مربوط به ریشههاي موئین شاهد و حداقل آن 0/45 - گرم - مربوط به ریشههاي موئین تیمار شده با غلظت 250 میلیگرم در لیتر عصاره مخمر بود. همچنین، مقایسه میانگین اثر متقابل سطوح مختلف غلظت و زمان تیمار با محرك عصاره مخمر نشان داد که میزان فعالیت آنتی اکسیدانی کل ریشههاي موئین بذرالبنج مشبک در سطح احتمال 1 درصد، به طور معنیداري تحت تأثیر غلظت و زمان تیمار قرار گرفته است. به طوري که، بیشترین میزان فعالیت آنتی اکسیدانی کل در اثر تیمار با غلظت 250 میلیگرم در لیتر عصاره مخمر به مدت 48 ساعت مشاهده گردید که نسبت به شاهد حدود 3 برابر افزایش نشان داد و کمترین میزان آن تحت تأثیر تیمار با غلظت 125میلیگرم در لیتر عصاره مخمر به مدت 72 ساعت به دست آمد - نمودار . - 3 همچنین با افزایش مدت زمان تیمار، میزان فعالیت آنتی اکسیدانیکلریشههاي موئین روند کاهشی داشت. طی تنش اکسیداتیو، وقایعی در گیاهان صورت میگیرد که عبارتند از افزایش تولید ROS، افزایش میزان آنتی اکسیدانها، افزایش پرولین و افزایش پراکسیداسیون لیپیدي که منجر به افزایش تحمل گیاه به تنش میشوند. در پژوهش حاضر نیز، افزایش فعالیت آنتی اکسیدانی کل احتمالاً به علت افزایش گونههاي فعال اکسیژن به ویژه پراکسید هیدروژن میباشد. این نتایج با نتایج تحقیق Abraham و همکاران - 2011 - در کشت گیاهچههاي Curcuma mangga مطابقت دارد. در این پژوهش، کروماتوگرام-هاي حاصل از آنالیز GC-MS عصارههاي استخراج شده از ریشههاي موئین بذرالبنج مشبک تیمار شده با سطوح مختلف غلظت عصاره مخمر در زمانهاي مختلف، نشان دهندهي افزایش میزان پرولین نسبت به کشتهاي شاهد میباشد - شکل 1 و . - 2 به نظر میرسد اختصاص کربن بیشتر در ساختار مواد آلی مؤثر در تنظیم اسمزي، همچون پرولین میتواند باعث کاهش رشد شود. بنابراین، در پژوهش حاضر سنتز بیشتر پرولین در اثر تیمار ریشههاي موئین با عصاره مخمر، ممکن است یکی از عوامل کاهندهي رشد باشد. اثرات سمی غلظتهاي بالاي عصارهي مخمر و نیز افزایش مدت زمان تنش میتواند از دلایل دیگر کاهش رشد ریشه-هاي موئین باشد. نتایج حاصل از این پژوهش با نتایج تحقیقات Hong و همکاران - 2012 - در کشت ریشههاي Hyoscyamus niger و El- Nabarawy و همکاران - 2015 - در کشت کالوس Zingiber officinale، مطابقت دارد.
جدول -1نتایج تجزیه واریانس تأثیر غلظت و مدت زمان تیمار با عصارهي مخمر بر رشد و میزان فعالیت آنتی اکسیدانی کلریشههاي موئین بذرالبنج مشبک
**,*, ns به ترتیب نشان دهندهي عدم وجود اختلاف معنی دار و وجود اختلاف معنی دار در سطح احتمال 5 و 1 درصد میباشد.
نمودار -2 مقایسه میانگین اثر اصلی زمان تیمار با عصاره مخمر بر وزن تر ریشههاي موئین بذرالبنج مشبک. حروف مشابه نشان دهندهي عدم وجود اختلاف معنی دار در سطح احتمال
نمودار -1مقایسه میانگین اثر اصلی غلظت عصارهي مخمر بر وزن تر ریشههاي موئین بذرالبنج مشبک. حروف مشابه نشان دهندهي عدم وجود اختلاف معنی دار در سطح احتمال 1 درصد آزمون تأثیر عصاره مخمر بر رشد و فعالیت آنتی اکسیدانی ریشههاي موئین بذرالبنج مشبک
