بخشی از مقاله
چکیده
بادرنجبویه با نام علمی Melissa officinalis L. گیاهی از خانواده نعناعیان - Lamiaceae - بوده و از گیاهان دارویی می-باشد که از مهمترین خواص دارویی میتوان به آرام بخشی، تقویت اعصاب، ضد نفخ و تقویت کننده حافظه اشاره کرد.کیتوزان از ترکیبات اصلی دیواره سلولی بسیاری از گونههای قارچی است که به عنوان الیسیتور زیستی برای بهبود بخشیدن بیوسنتز متابولیتهای ثانوی استفاده میشود. به منظور بررسی اثرکیتوزان بر میزان پراکسیدهیدروژن - H2O2 - ، میزانفعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان کاتالاز - CAT - و سوپر اکسید دیسموتاز - SOD - و آسکوربات پراکسیداز - APX - ، گیاه بادرنجبویه، آزمایشی با طرح بلوک کامل تصادفی با سه تکرار در پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه زابل انجام شد. تیمار کیتوزان در چهار سطح 0 ppm، 100، 150 و 200 بود.نتایج نشان داد میزان پراکسیدهیدروژن - H2O2 - وفعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان کاتالاز - CAT - وسوپراکسیددیسموتاز - SOD - وآسکوربات پراکسیداز - APX - ، نسبت به شاهد افزایش معنی داری نشان داد. به نظر میرسد به عنوان الیسیتور زیستی باعث افزایش فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان و افزایش تولید متابولیت های ثانویه میشود.
مقدمه
گیاه بادرنجبویه از تیره نعناعیان، چند ساله، با ساقه چهار گوش و بیکرک، ریشههای آن استوانهای شکل و خشبی و با ریشههای فرعی زیاد، برگهای آن بیضی شکل، دندانهدار و پوشیده از کرک، گلها هرمافرودیت، کامل و به رنگ زرد، بنفش یا سفید میباشد. میوه آن فندقه و چهار فندقه و قهوهای رنگ است. قسمت مورد استفاده آن برگ، سرشاخههای جوان و اسانس گیاه میباشد . - 4 - - 1 - این گیاه در بهبود قولنج دوران بچگی - 43 - ، رفع تنگی نفس مزمن، زکام و تب و لرز - 7 - ، از بین بردن برخی قارچها - 28 - ، به عنوان مسکن - 37 - ، تقویت حافظه - 42 - و بهبود آلزایمر - 10 - کاربرد فراوان دارد. گیاه فوق دارای خاصیت آنتیاکسیدانی بوده - 44 - و حاوی آلفا توکفرول - 29 - میباشد. روشهای متعددی برای افزایش تولید متابولیتهای ثانویه وجود دارد. الیسیتورها ترکیباتی با منشأ زیستی یا غیر زیستی هستند که از طریق القای سیستم دفاعی باعث بیوسنتز و انباشت متابولیتهای ثانویه میشوند . - 46 - کیتوزان از ترکیبات اصلی دیواره سلولی بسیاری از گونههای قارچی است. کیتوزان یک پلی ساکارید پلی کاتیونی، به عنوان الیسیتور زیستی کارآمد برای افزایش تولید متابولیتهای ثانویه گیاهان دارویی زیادی تأیید شدهاست . - 12 - یک پاسخ مهم در برابر الیسیتورهای زیستی توسط سلولهای گیاهی، تولید گونههای اکسیژن واکنشگر - ROS - مانند رادیکال سوپر اکسید - O20- - ، هیدروژن پراکسید - H2O2 - ، رادیکال هیدروکسیل - OH0 - و اکسیژن یکتایی - 1O2 - میباشد که سمی هستند ROS . - 11 - های تولید شده در سلولهای گیاهی به وسیله سیستمهای آنتی اکسیدان آنزیمی و غیر آنزیمی کنترل میشوند . - 41 - کنترل سطح آنتی اکسیدانها توسط سیستمهای آنتیاکسیدانی حاصل میشود که شامل متابولیتهایی چون گلوتاتیون، آسکوربات، آلفاتوکوفرول، هیدروکوئینونها، بتا کاروتن، فلاونوئیدها و آنزیمهای روبندگی اکسیژن واکنشگر - ROS - مانند پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز و پلی فنل اکسیداز میباشد . - 40 - این آنزیمها نقش بسیار مهمی در غیر فعال کردن رادیکالهای آزاد اکسیژن در سلول گیاهان دارند، بسته به گونه گیاهی و شدت تنش میزان فعالیت آنها در گیاهان تغییر میکند . - 6 - در صورتیکه سمیتزدایی از اکسیژنهای واکنشگر - ROS - صورت نپذیرد آسیب جدی به کلروفیلها، پروتئینها، لیپیدهای غشایی و اسیدهای هستهای وارد میشود .6 - - کیتوزان اخیراً بدلیل فعالیتهای آنتیاکسیدانی توجه زیادی را به خود جلب کردهاست . - 17 - کلروپلاست و میتوکندری سلولهای گیاهی از مهمترین تولیدکنندگان گونههای فعال اکسیژن هستند. الکترونهای نشت کرده از زنجیره انتقال الکترون میتوانند با اکسیژن مولکولی حاصل از متابولسیم طبیعی گیاه، ترکیب شده و تولید اکسیژن واکنشگر - ROS - کنند. این گونههای اکسیژن سمی و بسیار واکنشپذیرند و در غیاب مکانیسمهای حفاظتی میتوانند متابولیسم طبیعی سلول را به میزان زیادی مختل کنند . - 38 - - 14 - هدف از این تحقیق بررسی اثر کیتوزان بر پراکسیدهیدروژن - H2O2 - و میزان فعالیت برخی آنزیمهای آنتی اکسیدان از جمله کاتالاز - CAT - وسوپراکسیددیسموتاز - SOD - وآسکوربات پراکسیداز - APX - ، میباشد.
مواد و روشها
کشت و آماده سازی بادرنجبویه
برای انجام این پژوهش بذرهای بادرنجبویه در سال 1392 از مرکز تحقیقات کشاورزی زابل تهیه و در گلدانها در خاکتقریباً سبک از مخلوط مساوی ماسه الک شده، رس، گیاخاک و کود حیوانی کشت شد. پس از کشت، گلدان ها به گلخانه منتقل شدند و در شرایط یکسان در دمای روزانه 25 تا 30 و شبانه 18 تا 20 درجه سانتی گراد تا انتهای مرحله گلدهی رشد کردند. گلدانها روزانه آبیاری شدند و هفته ای 2 بار به آنها مقدار 50 میلی لیتر محلول غذایی هوگلند داده شد.
تیمار با کیتوزان
برای تهیه محلول کیتوزان از روش خان و همکاران - 22 - استفاده شد. اعمال محلول کیتوزان در مرحله پیشگلدهی با غلظتهای ppm 0، 100، 150 و 200 به صورت محلولپاشی روی سطح برگ و در طی سه مرحله انجام شد سپس اندامهای هوایی گیاه پس از تیمار کیتوزان به منظور مطالعات بعدی، برداشت شدند. به این منظور بخش هوایی گیاهان از خاک جدا گردید و برای بررسی شاخصهای مورد نظر در دمای -20 درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
تعیین مقدار هیدروژن پراکسید - H2O2 -
بدین منظور 200 mg بافت گیاهی منجمد شده، روی یخ با3mL تری کلرو استیک اسید تا مرحله همگن شدن سائیده و سپس سانتریفوژ 12000rpm - ، به مدت 15 دقیقه - شدند. به 0/5mLاز محلول روشناور، 0/5 mL بافر فسفات پتاسیم 10mM - ، - PH=7 و 1mL یدید پتاسیم اضافه شد و جذب آن در طول موج 390 نانومتر با اسپکتروفتومتر قرائت شد. با استفاده از منحنی استاندارد مقدار پراکسید هیدروژن محاسبه گردید . - 5 -
اندازهگیری آنزیمهای آنتی اکسیدان
جهت اندازهگیری آنزیمها، 0/2 گرم از بافت سبز برگ برداشت و با 4cc بافرپتاسیم فسفات 100 میلیمولار - PH=7 - و محلولEDTA0/1mMدر هاون سرد کاملاً ساییده، به صورت همگن در آورده شدند. مخلوط همگن از کاغذ صافی عبور و به مدت 15 دقیقه با دور 16000 سانتریفیوژ شدند. سپس فاز بالایی به عنوان عصاره پروتئینی برای سنجش فعالیت آنزیمی استفاده شد. همه این عملیاتها در دمای 4 درجه سانتیگراد انجام گرفت. در نهایت برای اندازهگیری فعالیت آنزیم کاتالاز - CAT - از روش بیرز و سیزر - 9 - ، آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز - - SOD از روش گیانوپولیتز و رایس - 15 - و آنزیم آسکوربات پراکسیداز - APX - از روش ناکانو و آسادا - 31 - استفاده شدند.
تجزیه و تحلیل آماری
همه آزمایشها با 3 تکرار به صورت طرح بلوک کامل تصادفی انجام گرفت. مقایسه میانگینها با استفاده از نرم افزار SAS وآزمون چند دامنه ای در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.
نتایج
تأثیر کیتوزان بر مقدار هیدروژن پراکسید - H2O2 - اندام هوایی مقایسه میانگین نتایج حاصل از تأثیر کیتوزان بر مقدار هیدروژن پراکسید - H2O2 - اندام هوایی نشان داد با افزایش غلظت کیتوزان از صفر - نمونه شاهد - تا 200 ppm مقدار هیدروژن پراکسید - H2O2 - از یک روند افزایشی پیروی میکند. به طوری که غلظتهای مختلف 100ppm - ، 150 و - 200 کیتوزان نسبت به شاهد باعث افزایش معنیداری مقدار هیدروژن پراکسید - H2O2 - شد - شکل. - 1
شکل-1مقدار هیدروژن پراکسید - H2O2 - اندام هوایی تحت تأثیر کیتوزان. حروف یکسان بیانگر عدم معنیداری در سطح 5 درصد میباشد.
تأثیر کیتوزان بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز - CAT - اندام هوایی بررسی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز - CAT - اندام هوایی تحت تأثیر کیتوزان نشان داد که با افزایش غلظت کیتوزاناز صفر - نمونه شاهد - تا 200 ppm فعالیت آنزیم کاتالاز - CAT - از یک روند افزایشی پیروی میکند. به طوری که غلظتهای مختلف 100ppm - ، 150 و - 200 کیتوزان نسبت به شاهد باعث افزایش معنیداری میزان فعالیت آنزیم کاتالاز - CAT - شد
تأثیر کیتوزان بر میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز - SOD - اندام هوایی
بررسی میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز - SOD - اندام هوایی تحت تأثیر کیتوزان نشان داد بیشترین میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز - SOD - در غلظت 200 ppm کیتوزان مشاهده شدو به همین ترتیب میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز - SOD - نسبت به نمونههای شاهد به طور معنیداری بیشتر بود
