بخشی از مقاله
چکیده
گیاه دارویی سنبلالطیب بهدلیل داشتن اثرات آرامبخش، ضد تشنج و ضد اضطراب از اهمیت بالایی در صنایع دارویی برخوردار است. کشت درونشیشهاي ریشههاي موئین میتواند به عنوان یک روش بیوتکنولوژیکی جایگزین مناسب براي تولید متابولیتهاي ثانویهي گیاهی مورد استفاده قرار گیرد. در این تحقیق تاثیر غلظتهاي مختلف ال-لوسین بر کشتهاي ریشه موئین تراریخته سنبلالطیب مورد بررسی قرار گرفت. براي این منظور، ریشههاي موئین با غلظتهاي صفر - شاهد - ، 1 و 2 میلیمولار ال-لوسین تیمار شده و در زمانهاي مختلف، رشد - وزن خشک - ریشهها، فعالیت آنزیمهاي کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز، میزان پراکسید هیدروژن و والرنیک اسید در آنها مورد اندازهگیري قرار گرفت. نتایج نشان داد که تیمار ریشهها با ال-لوسین باعث کاهش رشد ریشهها شده است. میزان کاهش رشد در تیمار دو میلیمولار ال-لوسین بیشتر از تیمار یک میلیمولار آن بود. درحالیکه تیمار 1 میلیمولار ال-لوسین سبب افزایش معنیدار میزان والرنیک اسید در ریشههاي موئین نسبت به تیمار شاهد گردید. فعالیت آنزیمهاي کاتالاز و پراکسیداز با اعمال تیمار لوسین 1 و 2 میلیمولار نسبت به شاهد افزایش، ولی فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز کاهش نشان داد. مقدار پراکسید هیدروژن در دورههاي زمانی 4 روز بیشتر از دورههاي زمانی 12، 24 و 48 ساعت بود.
مقدمه
امروزه با پیشرفتهاي حاصل در شیمی آلی و تحولات چشمگیر در روشهاي استخراج، تخلیص و تعیین ساختمان ترکیبات طبیعی گیاهان، ارزش داروهاي حاصل از منابع گیاهی روز به روز بیشتر شده است. گیاه دارویی سنبلالطیب بهدلیل داشتن اثرات متعدد ضددرد، تسکیندهنده اعصاب و ضد بیخوابی در صنایع دارویی داراي اهمیت زیادي میباشد. بیشترین قسمت مورد استفاده این گیاه براي مصارف درمانی، ریشه و ریزوم آن میباشد. بهعلت برداشت بیرویه و بیش از حد ریشههاي این گیاه دارویی با ارزش، امروزه بقاء این گیاه در رویشگاههاي طبیعی در معرض خطر قرار گرفته است. کشت درونشیشهاي ریشههاي موئین حاصل از تلقیح با Agrobacterium rhizogenes یک راهکار بسیار موثري را براي تولید متابولیتهاي ثانویهي با ارزش گیاهان بهویژه متابولیتهاي سنتز شده در سلولهاي تمایز یافته ارایه میکند. از ویژگیهاي ریشههاي موئین میتوان به رشد سریع در محیط فاقد هورمون، انشعابات جانبی زیاد، پایداري ژنتیکی و قابلیت تطابق با طراحی بیوراکتور1 اشاره نمود - . - 3 علاوهبراین، تولید و تجمع متابولیتهاي ثانویه در کشتهاي درونشیشهاي را میتوان با استفاده از راهکارهاي مختلف افزایش داد. پیشسازها شامل ترکیبات زیستی مختلفی هستند که در ابتدا و یا میانه مسیر بیوسنتزي متابولیتهاي ثانویه وجود دارند و افزودن آنها به محیط کشت میتواند میزان تولید محصول نهایی مورد نظر را افزایش دهد. اسیدهاي آمینه از جمله ترکیباتی هستند که به عنوان پیشسازها در محیطهاي کشت بهمنظور افزایش تولید متابولیتهاي ثانویه به کار میروند . - 5 - بنابراین، این تحقیق به منظور بررسی تاثیر اسیدآمینه ال-لوسین بر رشد درونشیشهاي ریشههاي موئین سنبلالطیب و تولید متابولیت ثانویه والرنیک اسید در آنها انجام گرفت.
مواد و روشها
ابتدا ریشههاي موئین با استفاده از ریزنمونه دمبرگ و سویهي خA آگروباکتریوم رایزوژنز القاء شد و پس از اینکه ریشهها به اندازه دو سانتیمتر رشد کردند، به شیشههاي حاوي 50 میلیلیتر محیط کشت حق مایع و ئَ؟ع 300 سفوتاکسیم منتقل شدند. نگهداري کشتها روي شیکر با 120 دور در دقیقه در دماي 24 ± 2 درجه سانتی گراد انجام گرفت. کشتها هر سه هفته یک بار زیرکشت شدند. پس از تکثیر ریشههاي موئین، در روز پانزدهم بعد از زیرکشت، غلظتهاي صفر، 1 و 2 میلی مولار لوسین بر این کشتها اعمال گردید. سپس در دورههاي زمانی 12، 24 و 48 ساعت و چهار روز پس از اعمال تیمارهاي فوق، ریشههاي موئین برداشت شده و وزن خشک ریشهها، فعالیت آنزیمهاي کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز و میزان پراکسید هیدروژن - 4 - و متابولیت ثانویه والرنیک اسید اندازهگیري شد. اندازهگیري والرنیک اسید با استفاده از دستگاه هعبد انجام گرفت. تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از نرمافزار خذححبح و ذحکحAح صورت گرفت.
نتایج و بحث
تجزیه واریانس دادهها نشان داد که وزن خشک ریشههاي موئین، فعالیت آنزیمهاي کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز و میزان پراکسید هیدروژن و والرنیک اسید بهطور معنیداري تحت تاثیر ال- لوسین قرار گرفت. تاثیر زمانهاي پس از اعمال تیمار نیز روي شاخصهاي وزن خشک ریشههاي موئین، فعالیت آنزیمهاي کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز و میزان پراکسید هیدروژن معنیدار بود. بهطور کلی، تیمار سلولها با اسیدآمینه ال-لوسین باعث کاهش رشد - وزن خشک - ریشههاي موئین گردید. بهطوريکه در همه دورههاي زمانی پس از اعمال تیمار، وزن خشک ریشههاي موئین در تیمار شاهد بهطور معنیداري بیشتر از تیمار حاوي لوسین بود - شکل . - 1 شکل-1 تاثیر تیمار ال-لوسین بر وزن خشک ریشههاي موئین سنبلالطیب در زمانهاي 12، 24، 48 ساعت و 4 روز پس از اعمال تیمار. میانگینهاي داراي حروف مشترك، براساس آزمون دانکن در سطح احتمال %5 اختلاف معنیداري با یکدیگر ندارند. مقایسه میانگین تیمارها نشان داد حداکثر فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار لوسین 2 میلی مولار در زمانهاي 12 و 24 ساعت پس از اعمال تیمار بهدست آمد که به طور معنیداري بیشتر از تیمار 1 میلیمولار ال-لوسین و شاهد بود. پس از آن فعالیت این آنزیم دوباره کاهش پیدا کرده است - شکل -2 الف - . فعالیت آنزیم پراکسیداز نیز با اعمال تیمار لوسین 1 و 2 میلیمولار نسبت به شاهد افزایش پیدا کرده است، بهطوري که این آنزیم در تیمار لوسین 2 میلیمولار و در زمان 24 ساعت پس از اعمال تیمار بیشترین فعالیت را داشته است - شکل -2 ب - . فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در تیمارهاي حاوي ال-لوسین نسبت به شاهد کاهش داشته است و کمترین میزان فعالیت در تیمار لوسین 1 میلیمولار در زمان 48 ساعت پس از اعمال تیمار مشاهده شد - شکل -2 پ - . مقدار پراکسید هیدروژن نیز در زمانهاي 12و 48 ساعت و 4 روز پس از اعمال تیمار در تیمارهاي ال- لوسین 1 و 2 میلیمولار نسبت به شاهد افزایش داشته و فقط در زمان 24 ساعت پس از اعمال تیمار کاهش نشان داد - شکل 2
- ت - . آنزیمهاي جارو کننده گونههاي فعال اکسیژن - حقلض، سوپر اکسید دیسموتاز، کاتالاز، پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز و گلوتاتیون پراکسیداز سیستمهاي دفاعی آنزیمی گیاه را تشکیل میدهند. آنزیمهاي آنتی اکسیدان بهعنوان سریع ترین واحدهاي مقابله کننده در برابر حمله حقل ها بهشمار میآید، با افزایش سطح حقل بهویژه پراکسید هیدروژن در سلولها، فعالیت آنزیمهاي آنتیاکسیدان مانند پراکسیداز و کاتالاز افزایش مییابد . - 2 -
شکل-2 تاثیر تیمار ال-لوسین بر الف - فعالیت آنزیم کاتالاز، ب - فعالیت آنزیم پراکسیداز و پ - فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و ت - میزان پراکسید هیدروژن در ریشههاي موئین سنبلالطیب در زمانهاي 12،24،48 ساعت و 4 روز پس از اعمال تیمار. میانگینهاي داراي حروف مشترك، براساس آزمون دانکن در سطح احتمال %5 اختلاف معنیداري با یکدیگر ندارند.
تیمار لوسین 1 میلیمولار سبب افزایش معنیدار میزان والرنیک اسید نسبت به تیمار شاهد شد، درحالیکه لوسین 2 میلیمولار تغییر معنیداري در میزان تولید والرنیک اسید نسبت به تیمار شاهد نداشت - شکل . - 3 اضافه کردن پیشسازها به محیط به منظور هدایت جریان متابولیک به سمت تولید بیشتر محصولات مورد نظر، رویکرد جالبی براي بهبود بهرهبرداري بالقوه از آنزیمهاي درگیر در مسیرهاي متابولیکی ثانویه است. بهطوريکه ماماتا - 2000 - بیان کرد که افزودن پیشسازهاي سدیم
