بخشی از مقاله
چکیده
در این تحقیق ابتدا به صورت کیفی و سپس به صورت کمی میزان فعالیت آنزیم فیتاز از گونههای قارچی بررسی شد. نتایج نشان داد سه گونه قارچ آسپرژیلوس بر فعالیت آنزیم فیتاز و میزان حل شدن فسفر از منبع آلی در - 3 0/01 - معنیدار بود.
میزان فعالیت آنزیم فیتاز در بین این سه گونه قارچ آسپرژیلوس، در گونه آسپرژیلوس نایجر از دو گونه دیگر بیشتر بوده و مقدار آن 16/7 میکرومول در دقیقه بود. قارچ آسپرژیلوس فلاووس نیز با دارا بودن مقدار فعالیت آنزیمی 4/66 میکرومول در دقیقه کمترین فعالیت آنزیمی را در بین سه گونه داشت. گونه آسپرژیلوس نایجر در حل کردن فسفر از منبع آلی فیتات سدیم نیز بهتر عمل کرده و میزان فسفر محلول در این تیمار نسبت به دو گونه دیگر اختلاف معنیداری - 3 0/01 - داشت. کمترین میزان فسفر محلول مربوط به گونه آسپرژیلوس فلاووس بود.
مقدمه
فسفر عنصر غذایی محدود کنندهای برای سیستمهای بیولوژیکی در محیط خاک میباشد. مقدار زیادی از فسفر وارد شده به خاک توسط کود، به سرعت از دسترس گیاه خارج میگردد و در بخشهای معدنی خاک انباشته میشود؛ که علت آن ناشی از فرآیندهای شیمیایی جذب و رسوب است. مقداری از آن نیز در مواد آلی خاک غیر متحرک میگردند
در این بین نکته قابل توجه این است که بسیاری از خاکها دارای مقادیر زیادی فسفر میباشند که اگر کل آن قابل استفاده باشد، بیش از نیازهای رشد گیاهان و میکروارگانیسمها میباشد - ریچاردسون و همکاران، . - 2005 بیشترین بخش فسفر آلی - حدود 50 درصد - را اینوزیتول فسفات تشکیل میدهد.عدم وجود روشهای تحلیلی مناسب برای فسفر آلی خاک به همراه کمبود آگاهی از میزان و مکانیسمهای معدنی شدن فسفر آلی منجر به شیوههای نادرست مدیریتی شده است که موجب شده که این منبع عظیم فسفر نادیده گرفته شود
فراوانی فیتاتها و دیگر فسفاتهای آلی در خاک به دلیل حلالیت پایین آنهاست. از طرف دیگر این ترکیبات اتصالات محکمی با فاز جامد خاک دارند و این باعث پایداری بسیار بالای آنها در خاک میشود - ترنر و همکاران، . - 2005 فراهمی بیولوژیکی اینوزیتول فسفات به هیدرولیز آنها توسط فیتاز بستگی دارد. فیتازها به گروهی از آنزیمها اطلاق میشود که حداقل یک گروه فسفات از مولکول فیتات را جدا نمایند.
فیتازها بهطور متوالی اینوزیتول هگزاکیس فسفاتها را به ردههای پایینی مختلفی از استرها شامل منواسترهای اینوزیتول هیدرولیز میکنند. با توجه به فقدان فیتازهای برون سلولی از منشأ گیاهی و میکروارگانیسمهای خاک، به نظر میرسد که میکروارگانیسمها کلیدی برای چرخه فسفر از منشأ اینوزیتول فسفات در خاک میباشند.
فیتازهای برون سلولی از منشأ باکتریایی و قارچی میتوانند حلالیت عنصر غذایی فسفر را زمانی که در ریزوسفر موجود است را بهبود بخشند. فراهمی، پایداری و فعالیت فیتاز تراوش شده برای معدنی شدن به احتمال زیاد عامل مهمی در چگونگی استفاده از آنها در خاک میباشد. پنیسیلیوم و آسپرژیلوس از جمله قارچها و سودوموناس و باسیلوس از جمله باکتریهای حل کننده فسفات هستند که میزان معدنی شدن فسفر توسط آنها بستگی به فعالیت میکروبی و فعالیت فسفاتازها دارد.
روش های مختلفی از قبیل روش کمی و کیفی آزمایشگاهی برای تعیین فعالیت آنزیم فیتاز در محیط کشت وجود دارند. تاکنون ارتباط بین روشهای اندازهگیری فعالیت آنزیم در بخش آزمایشگاهی و آنچه که در عمل و در محیط خاک اتفاق میافتد به خوبی مورد بررسی قرار نگرفته است. تخمین هر چه بهتر موثر بودن یک گونه در بخش عملی یا همان شرایط واقعی خاک به انتخاب روشهای مناسب تخمین عملکرد در بخش آزمایشگاهی بستگی دارد. بنابراین هدف از انجام این تحقیق بررسی فعالیت آنزیم فیتاز سه گونه قارچ آسپرژیلوس به صورت کمی و کیفی و انتخاب بهترین گونه در این مورد بود.
مواد و روشها
در این تحقیق ابتدا به صورت کیفی و سپس به صورت کمی میزان فعالیت آنزیم فیتاز بررسی شد. بدین منظور سه گونه قارچی شامل: آسپرژیلوس نایجر - تهیه شده از گروه گیاه پزشکی دانشکده کشاورزی مشهد - ، آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس فامیگاتوس - تهیه شده از مرکز ملی ذخایر ژنیتیکی و زیستی ایران - تهیه شدند. تمام گونهها بر روی محیط کشت عمومی PDA - هر لیتر آب مقطر :عصاره 200 گرم سیبزمینی، 20 گرم گلوکز، 1 گرم عصاره مخمر دیفکو و 20 گرم آگار - کشت شدند و نمونه ها به مدت 5 روز در دمای 28 درجه سانتی گراد نگهداری شد.
ارزیابی نیمه کمی انحلال فسفات های آلی:
به منظور ارزیابی انحلال فسفات های نامحلول، جدایهها در محیط - SMM - synthetic minimum medium - گلوکز، 5؛ نیترات سدیم یا نیترات آمونیوم، 2؛ سولفات منیزیم، 0/5؛ کلرید پتاسیم، 0/5 و سولفات آهن، 0/01 گرم در لیتر - شامل منبع فسفر آلی - فیتات سدیم - به میزان 5 گرم در لیتر به عنوان تنها منبع فسفر مایه زنی شد. پس از 5 روز انکوباسیون در دمای 28 درجه سانتی گراد ، میزان فسفر معدنی ازاد شده اندازه گیری شد.
سنجش میزان فسفر آزاد شده در محیط:
پس از 5 روز کشتها سانتریفوژ شدند g7000 - به مدت ده دقیقه - و 5 میلیلیتر از مایع رویی عبور داده شده از کاغذ صافی واتمن 42 برای اندازهگیری فسفر استفاده شد. فسفر محلول در نمونهها با استفاده از روش مورفی و ریلی - 1962 - و به روش رنگسنجی اندازهگیری شد.
در این روش ابتدا معرف مخلوط شامل 50 میلی لیتر اسید سولفوریک 2/5 مولار، 15 میلی لیتر محلول مولیبدات آمونیوم 0/032مولار، 30 میلی لیتر محلول اسید اسکوربیک 0/1 مولار و 5 میلی لیتر محلول پتاسیم آنتیموان تارتارات 4/47 مولار تهیه شد. سپس 5 میلی لیتر از محلول رویی و نیز 8 میلی لیتر از معرف مخلوط داخل بالن ریخته و با آب دیونیزه به حجم 50 میلیلیتر رسانده شد. مقدار فسفر حل شده از طریق محاسبه مقدار فسفر محلول در نمونههای مایه زنی شده با جدایهها و شاهد - بدون مایه زنی - و تفریق این دو مقدار از یکدیگر به دست آمد.
تولید آنزیم فیتاز: برای تولید فیتاز نیاز به محیط کشت تخمیری است که بر طبق روش شیه و وار - 1968 - با کمی اصلاحات بهکار گرفته شد. در روش اصلاح شده، دکسترین جایگزین نشاسته محلول شده و پتاسیم دی هیدروژن فسفات بعنوان منبع فسفر استفاده میشود. بنابراین محیط کشت تخمیری اصلاح شده در هر 100 میلی لیتر شامل موارد ذیل می باشد:
5 گرم دکسترین، 2/5 گرم گلوکز، 0/86 0,86 گرم نیترات سدیم، 0/004 گرم پتاسیم دی هیدروژن فسفات، 0/05 گرم پتاسیم کلراید، 0/05گرم سولفات منیزیم 7 آبه و 0,01 گرم سولفات آهن 7 آبه.
اسیدیته محلول نیز قبل از سترون سازی 5,5 میباشد.
پس از ساخت محیط کشت تخمیر، 100 میلیلیتر لیتر از آن برداشته شد و به آن 10 میلیلیتر سوسپانسیون اسپور 5×107 - اسپور در هر لیتر - که از کشت گونهها در دمای 30°C بر روی محیط کشت PDA به مدت 7 روز تهیه شده است و با 10 میلی لیتر آب مقطر - شامل 0/1 میلی لیتر بر لیتر تویین - 80 شستشو داده شده،مایه زنی شد و به مدت 15 روز در دمای اتاق، نگهداری شد.
پس از تخمیر، محلول به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ - g10000 - شد که میسیلیوم ها جدا شوند و مایع شناور شفاف جمعآوری شد. به عصاره استخراج شده سولفات آمونیوم برای رسیدن به غلظت نهایی 25 درصد اضافه شد و به مدت یک ساعت در حالت شیک انکوبه شد و سپس به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ - g9000 - شد.رسوب خارج شد و آمونیوم سولفات به محلول رویی اضافه شد تا به غلظت 75درصد برسد.محلول به مدت 12 ساعت با شیک انکوبه شد وعصاره سلولی به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ - - 9000g شدند و محلول رویی خارج و رسوب در 5 میلی لیتر بافر 25 - TRIS-HCl میلی مولار، اسیدیته برابر با - 7/2 حل شد و در همین بافر به مدت یک شب دیالیز شد.
سنجش فعالیت آنزیم فیتاز: برای سنجش فعالیت آنزیم تجزیه کننده فیتات از روش اصلاح شده هیوننو لاهتی - 1981 - استفاده خواهد شد. در این روش 10 میلیلیتر از کشت سلولی سانتریفیوژ 13000 - دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد و به مدت 30 دقیقه - شد و سپس مایع رویی برای اندازه گیری فعالیت آنزیم فیتاز مورد استفاده قرار گرفت. ارزیابی اسپکتروفتومتری در حجم 2 میلیلیتر و در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه و با استفاده از بافرهای TRIS-HCL - اسیدیته - 7/4 و استات سدیم - اسیدیته - 5 شامل فیتات سدیم 10 میلیمولار انجام شد.
واکنش با افزودن 1,5 میلیلیتر از معرف استن، اسید سولفوریک 5 نرمال و آمونیوم مولیبدات 10 میلی مولار - 2:1:1 حجمی/حجمی - متوقف شد. سپس 100 میکرولیتر اسید سیتریک به آن اضافه گردید. فعالیت آنزیم تجزیه کننده فیتات در طول موج700 نانومتر اندازهگیری شد. به منظور اندازهگیری فسفات آزاد شده، منحنی استاندارد با استفاده از غلظت 5-30 میلیمولار فسفات تهیه گردید. یک واحد فعالیت آنزیم فیتاز مقدار آنزیمی است که موجب آزادسازی یک میکرومول فسفات آلی در دقیقه تحت شرایط آزمایشگاهی گردد.
در نهایت دادهها با استفاده از نرمافزار آماریjump11 در سطح معنیداری 1 درصد آنالیز شده و مقایسه میانگینها هم به روش LSD انجام شد.
نتایج و بحث
تاثیر سه گونه قارچ آسپرژیلوس برا فعالیت آنزیم فیتاز و میزان حل شدن فسفر از منبع آلی در سطح یک درصد معنیدار بود - جداول 1 و . - 2
مقایسه بین سه گونه قارچ مورد آزمایش، نشان داد که میزان فعالیت آنزیم فیتاز در گونه آسپرژیلوس نایجر از دو گونه دیگر بیشتر بوده و مقدار آن 16/7 میکرومول در دقیقه بود. قارچ آسپرژیلوس فامیگاتوس نیز با دارا بودن مقدار فعالیت آنزیمی 4/66 میکرومول در دقیقه کمترین فعالیت آنزیمی را در بین سه گونه داشت. نتایج به دست آمده با نتایج که نشان داده شد که آسپرژیلوس نایجر بهترین تولید کننده آنزیم فیتاز میباشد بانتایج - 1986 - Shieh and War و Lee وهمکاران - - 2005 مطابقت داشت.
پارامتر دیگر اندازهگیری شده در این آزمایش میزان فسفر حل شده از منبع آلی فیتات سدیم بود. نتایج نشان داد که گونه آسپرژیلوس نایجر در حل کردن فسفر از منبع آلی فیتات سدیم نیز بهتر عمل کرده و میزان فسفر محلول در این تیمار نسبت به دو گونه دیگر بهطور معنیداری - 3 0/01 - بیشتر بود. کمترین میزان فسفر محلول مربوط به گونه آسپرژیلوس فلاووس بود.
