بخشی از مقاله
چکیده:
معادن فلزات طلا و نقره، صنایع آب فلز کاري، صنایع شیمی آلی و نفت، تولید کنندهي پسابهاي آلوده به سیانید هستند که براي موجودات زنده شدیداٌ سمی میباشد،چون سیانید به فر م آزاد کمپلکس پایداري با فلزات مهمی چون آهن تشکیل میدهد که آهن براي فعالیت پروتئینهاي زیستی نظیر سیتوکروم اکسیداز موردنیاز میباشد. روشهاي فیزیکی و شیمیایی قابل دسترسی براي حذف سیانید وجود دارد که بسیار گران میباشد.
روشهاي بیولوژیکی تجزیهي سیانید در دو دههي اخیر بسیار مورد توجه قرار گرفته است. در این مقاله تجزیهي زیستی سیانید در پسابهاي با pH قلیایی که ناشی از معادن فلزاتی چون طلا و نقره است بررسی شده است. استرین - - strain جدیدي از باکتري Autochthonous به نام Pesudomonas pesudoalcaligene CECT 5344 از سواحل رودخانهاي دراسپانیا ایزوله شده که قادر به تجزیه سیانید آزاد و کمپلکس فلز سیانید در pH =11.5- 12 میباشد و نیز 30 mM سیانید آزاد را تحمل می کند. داراي پروتئینی به نام CNO میباشد که در حضور سیانید القا میشود ودر بیوسنتز سیدروفورها در پاسخ به سیانید نقش دارد.
این باکتري هوازي، گرم منفی، متحرك،میله اي شکل؛ بدون اسپور، کاتالاز و اکسیداز مثبت و از سیانید به عنوان منبع نیتروژن استفاده میکند. براي جداسازي این باکتري از محیط کشت M9 - بدون آمونیوم و سیترات - و لجن رودخانهي گودال - منبع نیتروژن و کربن - به آن تلقیح شده است استفاده شد؛ پس از PCR و Blasting Analysis مشخص شد 99درصد شبیه به Pesudomonas pesudoalcaligenes CECT 5344 میباشد.
مقدمه:
سیانید یک ترکیب طبیعی تولید شده توسط بسیاري از ارگانیسمها شامل باکتري، جلبک، قارچ و گیاهان است و در بعضی موارد به صورت یک متابولیت دفاع کننده و یا با هدف تهاجم تولید میشود . - 2 - گیاهان منابع اصلی سیانید در بیوسفر هستند و به طور همزمان سیانید را با اتیلن تولید میکنند به علاوه تولید کنندهي سیانوگلیکوزید و سیانولیپید هستند - . - 4 معادن فلزات طلا و نقره، صنایع آب فلز کاري، صنایع شیمی آلی و نفت، تولید کنندهي پسابهاي آلوده به سیانید هستند که براي موجودات زنده شدیداٌ سمی میباشد.تجزیهي زیستی سیانید و ترکیبات وابسته به آن یکی از مهمترین پروسههاي بیوتکنولوژي است که در دو دههي اخیر ظاهر شده است.صدها گونهي میکروبی و گیاهی مثل باکتري، قارچ، جلبک میتواند سیانید را سم زدایی نماید و یا سمیت آن را کاهش نماید - . - 6
مواد و روشها:
-1 کشت و جداسازي باکتري
باکتري P. pesudoalcaligenes CECT 5344 از لجنهاي سواحل رودخانهاي در شهر کوردوباي اسپانیا که حاوي پسابهاي جواهرسازي بود، توسط روش کشت غنی شده ایزوله گشت - . - 3 در ادامه براي خالص سازي از محیط کشت حداقل - M9 محیطی بدون آمونیوم و سیترات، pH9.5، NACN 2.5mM ، استات 50mM، و تلقیح لجن به عنوان منبع نیتروژن و کربن - و محیط کشت LB - Luria -Bertani - جامد شده با 1.8 درصد باکتوآگار - - DIFCO استفاده شد در نهایت کلنیهاي تک خالص شده به محیط مایع داراي سیانید بدون منبع نیتروژن انتقال داده شد.
-2 شناسایی باکتري ایزوله شده:
به منظور شناسایی دقیق باکتري ایزوله شده، از روشهاي مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و فیلوژنتیکی استفاده گشت. جهت شناسایی فیلوژنتیکی، کل ژنوم باکتري ایزوله شده استخراج شد سپس توسط پرایمرهاي اختصاصی یونیورسال یوباکتریال EUB-8F و EUB-1492ژن 16SrRNA با استفاده از PCR تکثیر گشت. سپس محصول PCR بر روي ژل آگارز الکتروفورز گشت و بعد از خالص سازي، تعیین توالی شد و در NCBI براي بررسی همولوژي بلاست گشت. بعد از مشخص شدن همولوژي، باکتري ایزوله شده با کمک خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی جهت شناسایی نهایی مورد بررسی قرار گرفت.
-3انتخاب محیط کشت مناسب
جهت رشد باکتري مورد نظراز شرایط هوازي وارلن مایر فلاسک حاوي محیط کشت مایع LB یا M9 در شیکر انکوباتور با دماي 30 0 C و دور 230 rpm و pH 9.5 استفاده شد.محیط درون ارلن مایر حاوي NACN 2Mmو 50mM استات به عنوان تنها منبع نیتروژن و کربن میباشد. در ادامه براي غنی سازي از محیط LB جامد شده با 1.8 درصد آگار استفاده گشت.
نتایج و بحث:
استرین جداسازي شده به وسیله کشت غنی شده در محیطهاي انتخابی درpH 9.5 با NACN 2 mM به عنوان تنها منبع نیتروژن که در قسمت مواد و روشها توصیف شد به صورت کمی خمیده، هوازي، میلهاي شکل - .4-1.5 میکرومتر - و گرم منفی میباشد. این باکتري علاوه بر سیانید قادر به استفاده از آمونیوم ، نیترات، نیتریت، سیانواستامید، نیتروفریک سیانید، چندین اسید آمینه و تعدادي کمپلکس فلز- سیانید به عنوان منابع نیتروژن میباشد. این باکتري از استات، مالات و گلوکز به عنوان منابع کربن استفاده میکند.
با استفاده از روش فیلوژنتیکی 16 srRNA مشخص شد که باکتري مورد نظر 99 درصد مشابه P. pesudoalcaligenes CECT 5344 میباشد. سیانید براي موجودات زنده شدیدا سمی است به خاطر اینکه شکل آزاد سیانید کمپلکس پایداري با فلزات مورد نیاز براي عملکرد پروتئینها مثل آهن و سیتوکروم اکسیداز تشکیل میدهد. ارگانیسمی که در حضور سیانید رشد میکند بایستی متابولیسمی غیر حساس به سیانید داشته باشد مثل وجود یک اکسیداز آلترناتیو در گیاهان یا سیتوکروم bd در باکتريها. تکثیر باکتري سیانوتروفیک در حضور سیانید نیازمند جذب فلزات خاصی است. این استراتژي جذب آهن براي بسیاري از سیستمهاي بیولوژیکی مورد نیاز است.
به علت نقش متنوعی که آهن در واکنشهاي احیایی و اعمال ساختمانی دارد. این استراتژي شامل تولید ترکیباتی است که معمولا سیدروفور نامیده میشود که به طور شدیدي به آهن باند میشود و متعاقب انتقال آن آهن مصرف میشود. به طور کلی یک میکروارگانیسم سیانوتروف براي اینکه بتواند سیانید را مصرف کند حداقل به سه پروسهي جدا از هم نیاز دارد: .1 زنجیرهي تنفسی غیر حساس به سیانید.2 سیستم جذب آهن - سیدروفورها - .3 مسیر جذب سیانید.
اکثر میکروارگانیسمها در pH خنثی و اسیدي سیانید را حذف میکنند اما میکروارگانسیمهایی که در pH قلیایی قادر به انجام این کار میباشند کمیاباند. در میکروارگانیسمهاي واجد شرایط سه نوع واکنش آنزیمی براي تجزیهي سیانید ضروري میباشد.
1 واکنشهاي انتقال و جایگزینی .2 واکنشهاي هیدرولیتیک .3 واکنشهاي اکسیداتیو. انجام این واکنشها مستلزم فعالیت هاي آنزیمی ویژهاي میباشد. این آنزیمها شامل احیاي نیترات - 1 - ، سیاناز، سیانید اکسیژناز، سیانیداز، فرمامید هیدرولاز، روداناز - 5 - میباشد. باکتريهایی از قبیل فوزاریوم سولانی - - Fusarium solani - پاتوژن گیاهی - ، باکتري بورخ هولداریا سپاشیا - - Burkh huldarya sepashya نیز قادر به تجزیهي سیانید میباشند ولی به دلیل گران بودن منبع کربن مورد استفاده آنها - گلوکز - و حساس بودن به یونهاي آهن و مس کاندیدهاي خوبی براي تجزیهي بیولوژیکی سیانید نمیباشند.
در نهایت باکتري P. pesudoalcaligenes CECT5344 بهترین گزینه براي حذف سیانید در شرایط حداقل مواد معدنی، بدون گلوکز و تحت شرایط قلیایی حاوي کمپلکسهاي فلز – سیانید و سیانید میباشد. به علاوه توانایی استفاده از سیانید در حضور فلزات سنگین، آمونیوم و نیترات و همچنین مقاومت به سیانید را دارد.
