بخشی از مقاله
اي با استفاده از قارچ ریسه هاي آروماتیک چند حلقهتصفیه زیستی پساب آلوده به هیدروکربن سفید فانروکائت کرزوسپوروم در بیوراکتور بستر ثابت
چکیده
حذف زیستی به وسیله قارچ ریسه سفید تثبیت شده میتواند جایگزینی براي تصفیه آب و پسابهاي آلوده به آلایندههاي آلی از قبیل هیدروکربنهاي آروماتیک چندحلقهاي (PAH) باشد. در این پژوهش بیوراکتور بستر ثابت به همراه قارچ تثبیت شده براي تجزیه PAH در محیط کشت حاوي این آلاینده به وسیله قارچ ریسه سفید فانروکائت کریزوسپوروم به کار رفت. این قارچ از طریق ترشح آنزیمهاي لیگنینی از قبیل لیگنین و منگنز پراکسیداز قادر به تجزیه ترکیبات مدل لیگنین از قبیل هیدروکربنهاي آروماتیک چند حلقهاي میباشد. تاثیرعوامل مختلف شامل شدت جریان خوراك ورودي به راکتور و غلظت اولیه آلاینده بر میزان حذف و فعالیت آنزیمهاي لیگنینی بررسی و بهینه سازي شد. نتایج بدست آمده حاکی از حذف %98 و فعالیت آنزیم MnP، 57 UL-1 و LiP، 426 UL-1 میباشد.
مقدمه
هیدروکربنهاي آروماتیک چند حلقهاي (PAH) داراي اثر سمیت و سرطانزایی بر روي میکروارگانیزمها، گیاهان و حیوانات هستند
و جز موادي هستند که خطر بسیاري متوجه سلامت انسان میکنند. PAH بر اثر سوختن ناقص سوختهاي فسیلی، پسابهاي آلی فرایندهاي گوناگون صنعتی تولید میشوند. خنثی بودن این ترکیب، حلالیت کم آنها در آب و خاصیت چربی دوستی زیاد آنها منجر به تجمع زیاد و حضور پایدار آنها در محیط میشوند. لذا حذف آنها در بسیاري از کشورها داراي اولویت است(.(1تصفیه زیستی، شامل استفاده از میکروارگانیزمها به منظور حذف آلودگی از خاك و آب روش مهمی در کنترل آلودگیهاي خاك و آب بوده و میتواند جایگزین فناوريهاي سنتی تصفیه شود.
تثبیت میکروارگانیزم به صورت بیوفیلم براي استفاده در فرایندهاي زیست محیطی بسیار مناسب است. در فرایندهاي زیست محیطی بر خلاف سایر فرایندهاي بیولوژیکی صنعتی، حجم زیادي از محلول آبی رقیق باید تصفیه شده ضمن اینکه بدون نیاز به جداسازي بیومس از جریان خروجی تصفیه شده، فرایند باید در بیومس بالامورد استفاده قرار گیرد. به منظور ایجاد واحد صنعتی فشرده و تضمین قابلیت اطمینان از راکتورهاي بیوفیلمی استفاده میشود. مزیت راکتورهاي فیلم ثابت عبارتند از: پایداري عملیات فرایند، فشردگی و کوچکی فرایند،حذف صاف کننده دوم، قابلیت تطبیق به تغییر بار ورودي، و شروع سریع(.(2
تفاوت اصلی قارچ ریسه سفید با سایر میکروارگانیزمها توانایی آنها در معدنی کردن تمامی ترکیبات مدل لیگنین است. تجزیه آنزیمی لیگنین معمولا وابسته به گروهی از پراکسیدازهایی است که به وسیله این قارچ ترشح میشود. کشف اولین آنزیم لیگنینی اکساینده، لیگنین پراکسیداز (LiP) اساس بررسیهاي بعدي بود((3 و (4) ابتدا تجزیه لیگنین را وابسته به این آنزیم دانستند. اما با گذشت زمان دیده شد که تجزیه لیگنین به وسیله قارچ ریسه سفید در سیستمهاي بدون LiP نیز روي میدهد. علاوه بر آن پراکسیدازهاي دیگر از قبیل منگنز پراکسیداز (MnP) و لاکاز نیز کشف شدند و از اهمیت LiP کم شد. در عین حال لازم است تا فهم کامل این فرایند بیولوژیک صورت بگیرد تا بتوان از آن در سیستمهاي صنعتی استفاده کرد(.(5 در بین آنزیمهایی که به وسیله قارچ ریسه سفید ترشح میشود، LiP و MnP در تجزیه PAH بسیار موثرند. این آنزیمها، آنزیمهاي اصلی تولید شده به وسیله فانروکائت کریزوسپوروم نیز میباشند.(.(1 هدف این پژوهش بررسی حذف PAH در بیوراکتور در مقیاس آزمایشگاهی به منظور فهم سینتیک رشد و فعالیت آنزیمی قارچها و بهینه سازي شرایط عملیاتی میباشد.
مواد و روشها
کشت قارچ و آماده سازي مایع تلقیح قارچ ریسه سفید از آزمایشگاه بیوتکنولوژي دانشگاه صنعتی امیرکبیر تهیه گردید و در دماي 4 درجه سانتیگراد در اسلنتهاي حاوي عصاره مالت و آگار %2/5 نگهداري شد و کشت مجدد هر ماه صورت گرفت. به منظور تهیه مایع تلقیح اسلنتها با سرم فیزیولوژي حاوي %1 وزنی توئین 80 شستشو داده شد و از فیلتر عبور داده شد. محلول فوق به اندازهاي با آب مقطر استریل رقیق گردید تا در طول موج 650nm داراي جذب 0/5 باشد. تعداد اسپورها با استفاده از لام توما در زیر میکروسکوپ شمرده شد. ( cell .(2/4×106 ml-1 محیط کشت استفاده شده حاوي ترکیبات زیر به ازاي هر لیتر آب مقطر بود: گلوکز: 10 گرم، 2 KH2PO4 گرم، MgSO4.7H2O 0/5 گرم، 0/1 CaCl2 گرم، 0/03 MnSO4 گرم، 0/06 NaCl گرم، 6 FeSO4.7H2O میلیگرم، 6 CoCl2 میلیگرم، 6 ZnSO4.7H2O میلیگرم، 6 CuSO4 میلیگرم، 0/6 AlK(SO4)2.12H2O میلیگرم، 0/6 H3BO3 میلیگرم، 0/6 Na2MoO4.2H2O میلیگرم، عصاره مخمر 0/012 گرم، 0/2 C4H12N2O6 گرم، تیامین 1 میلیگرم، وراتریل الکل 0/07 گرم و توئین 0/5 80 گرم. pH محیط به وسیله سدیم استات 20mM به میزان 4/5 تنظیم شد(.(6 این محیط کشت در حقیقت محیط کشت پیشنهاد شده تین و کرك(4)1 و پادگورنیک2میباشد((7 که از برخی از ترکیبات آن صرفنظر شده است.
ستونی شیشهاي ژاکتدار با حجم عملیاتی300 ml از سنگهاي پوکه معدنی با اندازه تقریبی (0/5×0/5 cm) آکنده شد. کلیه تجهیزات به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو دماي 121 درجه سانتیگراد سترون گردید. در زیر هود بیولوژیک در ظرف حاوي محیط کشت به نسبت حجمی 1 به 10 از مایع تلقیح اضافه شد. سپس سیستم به مدت 4 روز به صورت ناپیوسته راهاندازي شد تا لایه بیوفیلم به اندازه مناسب بر روي سطح بستر رشد کند. پس از 4 روز،خوراك به صورت جریان پیوسته در شدت جریانهاي مختلف حاوي غلظتهاي مختلف از آلایندههاي فنانترن و پایرن به راکتور وارد شد
آنالیز PAH
به منظور استخراج، نمونهها به نسبت حجمی 1:1 با دي کلرومتان مخلوط شد و به مدت 24 ساعت در شیکر دوار قرار گرفت و سپس فاز آبی و آلی به وسیله قیف جداکننده دکانتور جدا شد(.(8 به منظور آنالیز از دستگاه HPLC مدل یانگلین آزمایشگاه دانشگاه صنعتی اصفهان استفاده شد. آشکارساز UV با انتشار امواج در طول موج 254 نانومتر قادر به آشکار سازي هیدروکربنهاي آروماتیک چند حلقهاي است. ستون نصب شده مدل μBandapack C18 محصول کارخانه واترز ایالت متحده میباشد.
اندازهگیري فعالیت آنزیمMnP
فعالیت منگنز پراکسیداز بر مبناي اکسیداسیون فنل رد انجام میشود . مخلوط واکنش حاوي 1ml سدیم سوکسینات 50mM (pH=4/5)، 1ml سدیم لاکتات (pH=5/0) 50mM، 0/4ml منگنز سولفات 0/1mM، 0/7 ml فنل رد 0/1mM، 0/4ml پراکسیدهیدروژن 50 μM، 1mg ml-1 و 0/5ml محلول خروجی فیلتر شده میباشد. واکنش با افزودن پراکسید هیدروژن آغاز می شود و تغییرات جذب در 610 نانومتر ثبت شد. یک واحد فعالیت آنزیم به صورت یک میکرومول فنل رد اکسید شده در واحد زمان به ازاي هر میلیلیتر محلول فیلتر شده تعریف میشود(.(9
اندازهگیري فعالیت آنزیمLiP
فعالیت لیگنین پراکسیداز بر مبناي اکسایش وراتریل الکل به وراتریل آلدئید انجام شد. مخلوط واکنش حاوي1ml از بافر سدیم تارترات (pH=3/0)125mM، 500μl وراتریل الکل 10mM، 500μl پراکسیدهیدروژن 2mM و 500μl از محلول خروجی فیلتر شده میباشد. واکنش با افزودن پراکسید هیدروژن آغاز میشود و تغییرات جذب در 310 نانومتر ثبت شد. یک واحد فعالیت آنزیم به صورت یک میکرومول وراتریل آلدئید تولید شده در واحد زمان به ازاي هر میلیلیتر محلول فیلتر شده تعریف میشود(.(10
