بخشی از مقاله
چکیده
روش هاي زیادي از جمله الایزا، جداسازي ویروس، روشهاي ملکولی تاکنون براي شناسایی بیماري BVD مورد استفاده قرار گرفته است. اخیراً روش رنگآمیزي ایمونوهیستوشیمی - IHC - بهعنوان یک روش قابلاعتماد براي تشخیص آنتیژنهاي ویروس در دامهاي زنده و همچنین در تشخیص پس از مرگ مورد استفاده قرار میگیرد.. لاشه دو گوساله 18 و 19 ماهه با تاریخچه اي از بی اشتهایی، تب بالا، اسهال خونی به سالن کالبدگشایی بخش پاتولوژي دانشکده دامپزشکی فرستاده شد. پس از بررسی ظاهري لاشه ها، جهت مطالعات هیستوپاتولوژي و ایمونوهیستوشیمیایی از دستگاه گوارش نمونه برداري انجام شد. نمونههاي بافتی در فرمالین بافر 10 درصد به میزان حداقل 10برابر بافت ثابت شد.
براي انجام مطالعات ایمونوهیستوشیمی، بعد از بررسی میکروسکوپیک اسلایدهاي رنگآمیزي شده با روش H&E ، مقاطع بافتی به ضخامت 4 میکرون از همان قالبهاي پارافینی تهیه شدند. براي رنگآمیزي ایمونوهیستوشیمی مقاطع بافتی و موضعی سازي آنتیژن، از کیت Novolink Polymer Detection System داراي محلولهاي آماده استفاده شد. بررسی هاي ظاهري بیانگر کانونهاي اروژن در حفره دهانی، هیپرمی، تورم و خونریزي در روده ها، تورم و ادم غدد لنفاوي مزانتریک بود. ضایعات هیستوپاتولوژي در مخاط روده شامل نفوذ سلولهاي آماسی تکهستهاي، بهویژه لنفوسیتها و ماکروفاژها، نکروز بافت پوششی کریپتهاي لیبرکوهن، بهویژه در سکوم و کولون بود که کریپتهاي مبتلا متسع و داراي موکوس، بقایاي سلولی نکروزه و لکوسیت ها بود. کریپتهاي لیبرکوهن دچار التهاب - آماس کریپت - شده بودند. گاهی کریپتها به لایه زیر مخاط نیز کشیده شده بودند - فتق کریپتها - . یافته هاي ایمونوهیستوشیمیایی شامل: گرانولهاي قهوهاي در سیتوپلاسم و اطراف هسته سلولهاي روده - انتروسیت - بود. همچنین این گرانولها در سیتوپلاسم سلولهاي پوششی کریپتها و سلولهاي التهابی که به مخاط و زیر مخاط نفوذ کرده بودند قابلمشاهده بود. حضور این گرانولها در بخشهایی از روده که آماس کریپتها و فتق کریپتها رخ داده بود بسیار مشهود بود.
کلمات کلیدي: BVD ، هیستوپاتولوژي، ایمونوهیستوشیمی
مقدمه
ویروس عامل اسهال ویروسی گاو متعلق به جنس پستی ویروس از خانواده فلیوي ویریده است اهمیت اقتصادي BVD در گلههاي گاوگوشتی و شیري روشن است و در اکثر کشورهاي جهان خسارات اقتصادي سنگینی را به صنعت دامپروري وارد میسازد. کشور ما نیز ازاینجهت مستثنی نبوده و اهمیت تشخیص موارد عفونت با توجه به امکان وقوع سایر بیماريهاي مشابه مانند طاعون گاوي و MCF در دامها دوچندان است.در استان فارس موارد متعددي از وقوع سقط جنین و تولد گوسالههاي با نواقص مادرزادي و همچنین عفونت حاد و مرگ گاوها با یافتههاي کالبدگشایی و ضایعات هیستوپاتولوژي کاملاً مشابه با عفونت ویروسی فوق تشخیص داده است. وجود موارد متعدد سقطجنین همراه با نواقص مادرزادي و تولد گوسالههاي ضعیف در گاوداريها شاهد دیگري بر وجود ویروس به میزان نسبتاً بالا در دامداري هاي کشور است. بسته به مرحله آبستنی عفونت میتواند منجر به مرگ جنین، سقط، ناهنجاري مادرزادي، تولد گوساله ضعیف و تولد گوساله داراي عفونت پایدار شود.
یکی از مهمترین اثرات آلودگی به BVDV در جنین تولد گوسالههاي PI است. جنین قادر به تولید پادتن علیه بیوتایپ غیرسایتوپاتیک ویروس در روزهاي 45-125 روز آبستنی نیست و ویروس در بدن آنها باقی میماند. این جنینها داراي تحمل ایمنی و ویرمی پایدار میباشند که بعد از تولد نیز این خصوصیات را حفظ خواهند کرد و بیماري مخاطی فقط در درصدي از این دامها ایجاد میشود. چنین گوسالههایی بعد از تولد ممکن است داراي ظاهري طبیعی یا کوچکتر بوده و رو به رشد نباشند. 50 درصد این گوسالهها در 12 ماه اولیه زندگی تلف میشوند و 10 درصد این گوسالهها حتی تا 5 سال نیز ممکن است زنده بمانند و ممکن است آبستن شده و گوسالههاي PI به دنیا بیاورند. این دام ها در طی مدتی که در گله وجود دارند ویروس را از طریق مواد ترشحی و دفعی، دفع میکنند و باعث انتشار ویروس میشوندعمدتاً. گوسالههاي PI در سنین 6 تا 24 ماهگی در اثر آلودگی با بیوتایپ سایتوپاتیک به بیماري مخاطی مبتلا می شوند.
روشهاي زیادي از جمله الایزا، جداسازي ویروس، روشهاي ملکولی تاکنون براي شناسایی این بیماري مورد استفاده قرار گرفته است. اخیراً روش رنگآمیزي ایمونوهیستوشیمی - IHC - بهعنوان یک روش قابلاعتماد براي تشخیص آنتیژنهاي ویروس در دامهاي زنده و همچنین در تشخیص پس از مرگ مورد استفاده قرار میگیرد. حساسیت و سرعت بالا از مزایاي این روش است. این روش تشخیصی بسیار اختصاصی و حساس است که با استفاده از نمونه هاي پایدار شده در فرمالین و قالبگیري شده با پارافین بر اساس چسبیدن آنتیباديها به آنتیژن هاي موجود در مقاطع بافتی استوار است. در این مطالعه یافته هاي هیستوپاتولوژي و ایمونوهیستوشیمیایی در دو گوساله مبتلا به BVD/MD توصیف خواهد شد.
مواد و روش کار
لاشه دو گوساله 18 و 19 ماهه با تاریخچه اي از بی اشتهایی، تب بالا، اسهال خونی به سالن کالبدگشایی بخش پاتولوژي دانشکده دامپزشکی فرستاده شد. پس از بررسی ظاهري لاشه ها، جهت مطالعات هیستوپاتولوژي و ایمونوهیستوشیمیایی از دستگاه گوارش نمونهبرداري انجام شد. نمونههاي بافتی در فرمالین بافر 10 درصد به میزان حداقل 10برابر بافت ثابت شد. بعد از 12 ساعت، فرمالین تعویض شد و مراحل آمادهسازي بافت شامل آبگیري با استفاده از الکلهاي با درجه صعودي انجام شد، پس از آن مرحله شفافسازي با استفاده از زایلول، خارج کردن الکل و آغشتگی در دستگاه اتوتکنیکون انجام شدنهایتاً. مرحله قالبگیري با استفاده از پارافین مذاب انجام گرفت. پس از تهیه برشهاي 4 تا 5 میکرونی، رنگآمیزي متداول هماتوکسیلین و ائوزین انجام شد و بهوسیله میکروسکوپ نوري موردمطالعه قرار گرفت.
براي انجام مطالعات ایمونوهیستوشیمی، بعد از بررسی میکروسکوپیک اسلایدهاي رنگآمیزي شده با روش H&E ، مقاطع بافتی به ضخامت 4 میکرون از همان قالبهاي پارافینی تهیه شدند. قابلذکر است که در این مرحله از اسلایدهاي پلی الایزینه براي برش استفاده شد تا مقاطع ضمن مراحل متعدد شستشو از روي اسلاید شسته نشوند. بعد از پارافین گیري به وسیله حرارت در آون، نمونهها براي انجام مراحل رنگآمیزي ایمونوهیستوشیمی آماده شدند. براي رنگآمیزي ایمونوهیستوشیمی مقاطع بافتی و موضعی سازي آنتیژن، از کیت Novolink Polymer Detection System - Newcastle Upon Tyne NE128EWRE7230-K, United Kingdom - داراي محلولهاي آماده استفاده شد. این روش نسبت به سایر روشهاي رنگآمیزي ایمونوهیستوشیمی بسیار حساستر است که سیستم ایجاد سیگنال هاي تقویتشده براي تشخیص آنتیژنهاي موجود در بافت حتی در غلظتهاي کم و یا تیتر پائین آنتی بادي را عرضه میکند.
نتایج
بررسی هاي ظاهري بیانگر کانونهاي اروژن در حفره دهانی، هیپرمی، تورم و خونریزي در روده ها، تورم و ادم غدد لنفاوي مزانتریک بود. ضایعات هیستوپاتولوژي در مخاط روده شامل نفوذ سلولهاي آماسی تکهستهاي، بهویژه لنفوسیتها و ماکروفاژها، نکروز بافت پوششی کریپتهاي لیبرکوهن، بهویژه در سکوم و کولون بود که کریپتهاي مبتلا متسع و داراي موکوس، بقایاي سلولی نکروزه و لکوسیت ها بود. در پارین مخاط سلولهاي آماسی تکهستهاي، بهویژه لنفوسیت ها و ماکروفاژها مشاهده شد. علاوه بر این، ادم، خونریزي و نفوذ سلولهاي آماسی در زیر مخاط نیز مشاهده شد. کریپتهاي لیبرکوهن دچار التهاب - آماس کریپت - شده بودند. گاهی کریپتها به لایه زیر مخاط نیز کشیده شده بودند - فتق کریپتها - . یافته هاي ایمونوهیستوشیمیایی شامل: گرانولهاي قهوهاي در سیتوپلاسم و اطراف هسته سلولهاي روده - انتروسیت - بود. همچنین این گرانولها در سیتوپلاسم سلولهاي پوششی کریپتها و سلولهاي التهابی که به مخاط و زیر مخاط نفوذ کرده بودند قابلمشاهده بود. حضور این گرانول ها در بخشهایی از روده که آماس کریپتها و فتق کریپتها رخ داده بود بسیار مشهود بود.
بحث و نتیجه گیري
تحقیقات متعددي در خصوص تعیین و شیوع آلودگی با ویروس عامل BVD/MD - با تأکید بر شناسایی پاسخهاي پادتنی - در کشور ما صورت پذیرفته که ارقام متنوعی را از شیوع نسبتاً بالاي آلودگی ارائه میدهندو همواره این پرسش وجود دارد که چگونه برنامهاي باید درراه مبارزه با این معضل در کشورمان اتخاذ گردد تا بتواند ضمن جلب رضایت دامداران، از این خسارات اقتصادي برآورد نشده ناشی از عفونت بکاهد. اهمیت اقتصادي BVD در گلههاي گاوگوشتی و شیري روشن است و در اکثر کشورهاي جهان خسارات اقتصادي سنگینی را به صنعت دامپروري وارد می سازد. کشور ما نیز ازاینجهت مستثنی نبوده و اهمیت تشخیص موارد عفونت با توجه به امکان وقوع سایر بیماريهاي مشابه مانند طاعون گاوي وMCF در دامها دوچندان است.
وجود موارد متعدد سقط جنین همراه با نواقص مادرزادي و تولد گوسالههاي ضعیف در گاوداريها شاهد دیگري بر وجود ویروس به میزان نسبتاً بالا در دامداريهاي کشور است. بسته به مرحله آبستنی عفونت میتواند منجر به مرگ جنین، سقط، ناهنجاري مادرزادي، تولد گوساله ضعیف و تولد گوساله داراي عفونت پایدار شود. بهطورکلی کنترل بیماري بسیار بااهمیت است که درراه مبارزه با این معضل، اولین و مورد تأکیدترین محور، همواره شناسایی و حذف گاوهاي داراي عفونت پایدار یا PI از گله ها است. روش هاي زیادي براي شناسایی حیوانات PI مورداستفاده قرار میگیرند. روش رنگ آمیزي ایمونوهیستوشیمی - IHC - بهعنوان یک روش قابلاعتماد براي تشخیص آنتیژنهاي ویروس در دامهاي زنده و همچنین در تشخیص پس از مرگ مورداستفاده قرار میگیرد. این روش قادر به تمایز حیوانات داراي عفونت پایدار از موارد مبتلا به عفونت حاد است. حساسیت این روش براي تشخیص دامهاي داراي عفونت پایدار تقریباً 100 درصد است.
تشخیص مطمئنBVDV با ایمونوهیستوشیمی بر اساس تشخیص توسط آنتیبادي مونوکلنال است که با طیف گستردهاي از ویروس هاي جداشده واکنش نشان میدهد. بیشتر آنتیباديهاي مونوکلنال، آنتیژنهاي BVDV در بافتهاي ثابتشده در فرمالین را تشخیص نمیدهند. آنتیباديهاي منوکلونال اختصاصی بیماري که با آنتی ژنهاي Erns - gp48 - و gp53/E2 واکنش نشان میدهند میتوانند طیف گستردهاي از ایزولههاي ویروس BVDV را تشخیص دهد. ژنهاي کدکننده Erns - gp48 - و gp53/E2 توالی همولوژي بالایی را بین پستی ویروسها دارند، بنابراین هدفی مناسب براي سیستم هاي تشخیصی طیف گستردهاي از جدایههاي BVDV میباشند.
