بخشی از مقاله
چکیده
به خاطر گسترش فزاینده عفونتهاي پستیویروس در سراسر جهان و حضور چهرههاي بسیار متفاوت ناشی از عفونت با این ویروسها در بین حیوانات مختلف، امروزه به ویژه در سیستم دامپروري مدرن، برنامهریزي جهت مبارزه با این بیماريها بهویژه بیماري اسهال ویروسی گاوها در زمره برنامههاي اصلی مبارزه با بیماريهاي عفونی است. بهطورکلی کنترل بیماري بسیار بااهمیت است که در راه مبارزه با این معضل، اولین و مورد تأکیدترین محور، همواره شناسایی و حذف گاوهاي داراي عفونت پایدار یا PI از گلهها است.
در مطالعه حاضر، از حداقل 400 رأس گوساله و گاو متعلق به تعدادي از گاوداريهاي استان فارس طی دو مرحله خون گیري به عمل آمد. در مرحله اول علاوه بر تهیهي بافی کوت نمونهها بهصورت جداگانه، بافیکوت نمونههاي مخلوط - pool - شامل حداقل 20 نمونه بافی کوت جمعآوري گردید. در صورت مثبت بودن هر مجموعه 20 تایی بهصورت مجزا آزمایش RT-PCR جهت مشخص نمودن آلودگی و حضور آنتیژن بر روي تکتک نمونههاي مجموعه انجام شد. جهت تشخیص عفونت حاد از عفونت پایدار نمونهگیري - خون - از گاوهاي آلوده به عفونت حداقل 2 هفته بعد تکرار شد و بافیکوت نمونهها جداسازي شد. نمونهها تا انجام آزمایش RT-PCR در فریزر -70 درجه سانتیگراد نگهداري گردید.
نتایج حاصل از آزمایش مولکولی با استفاده از زوج پرایمرهاي 324 و 326 که جهت تعیین پستی ویروس در نمونههاي Pool انجام شد مؤید مثبت بودن 5گروه 20 - تایی - از مجموع نمونههاي Pool بود. پس از شناسایی نمونههاي مخلوط مثبت، مجدداً آزمایش بر روي نمونهها بهصورت تکی انجام شد. آزمایش nested PCR بر روي نمونههاي مثبت با استفاده از زوج آغازگرهاي OI 100 و 1400 R و همچنین BD1 و BD2 انجام شد.
جهت تشخیص نمونه هاي PI، هر نمونه که در این مرحله مثبت بود مجدداً آزمایش nested PCR بر روي بافیکوت جداشده از نمونههاي مرحله دوم انجام گرفت و مشخص شد که 8 مورد از گاوها آلوده به فرم عفونت پایدار بیماري بودند روشهاي زیادي ازجمله ایمونوهیستوشیمی، جداسازي ویروس، PCR و الایزا براي شناسایی حیوانات PI مورداستفاده قرار میگیرند. RT-PCR همراه با تعیین توالی، توانایی تعیین تیپهاي مختلف ویروس را دارد. این آزمون بهعنوان یک روش مناسب براي شناسایی حیوانات PI مورد تأیید قرارگرفته است.
مقدمه
ویروس عامل اسهال ویروسی گاو متعلق به جنس پستی ویروس از خانواده فلیوي ویریده است. خانواده فلیوي ویریده داراي 3 جنس فلیوي ویروس، پستی ویروس و هپاسی ویروس است. جنس پستی ویروس شامل ویروس اسهال ویروسی گاوان - Bovine viral diarrhea virus "BVDV" - ، ویروس بیماري بردر - Border disease virus "BDV" - و ویروس طاعون خوکی - Hog cholera Virus "HoCV" - بوده که هرکدام ازنظر بیماريزایی و مخاطرات اقتصادي اهمیت ویژهاي را در دامپزشکی دارا میباشند. به خاطر گسترش فزاینده عفونتهاي پستیویروس در سراسر جهان و حضور چهرههاي بسیار متفاوت ناشی از عفونت با این ویروسها در بین حیوانات مختلف، امروزه به ویژه در سیستم دامپروري مدرن، برنامهریزي جهت مبارزه با این بیماريها بهویژه BVD در زمره برنامههاي اصلی مبارزه با بیماريهاي عفونی است.
بهطورکلی کنترل بیماري بسیار بااهمیت است که درراه مبارزه با این معضل، اولین و مورد تأکیدترین محور، همواره شناسایی و حذف گاوهاي داراي عفونت پایدار یا PI از گلهها است. در حیوانات PI، آنتیژن ویروس را میتوان در سرم و نمونههاي بافتی در طول زندگی و پس از ناپدید شدن آنتیبادي مادري تشخیص داد. تمامی منابع موجود در خصوص کنترل BVD بر شناسایی دقیق و حذف سریع موارد PI اجماع داشته و اولین قدم اساسی در زمینه ي مبارزه و حتی ریشهکنی بیماري در گلههاي صنعتی را این مسئله عنوان مینمایند.
با مشخص شدن بعد گسترده و اهمیت اقتصادي بسیار زیاد این معضل در کل کشور باید تحقیقات اپیدمیولوژیک متناسب جهت شناسایی عوامل خطر عمده و ارزیابی اقتصادي برنامههاي جاري را هدایت کرد و برنامههاي منظم و حسابشدهاي براي غلبه بر آن طراحی نمود. روشهاي زیادي ازجمله ایمونوهیستوشیمی، جداسازي ویروس، PCR و الایزا براي شناسایی حیوانات PI مورداستفاده قرار میگیرند. RT-PCR همراه با تعیین توالی، توانایی تعیین تیپهاي مختلف ویروس را دارد. این آزمون بهعنوان یک روش مناسب براي شناسایی حیوانات PI مورد تأیید قرارگرفته است.
مواد و روش کار
از حداقل 400 رأس گوساله و گاو متعلق به تعدادي از گاوداريهاي استان فارس طی دو مرحله خونگیري به عمل آمد. نمونههاي خون با سرنگهاي استریل 10میلیلیتر از سیاهرگ وداج گاوها اخذ شد و به درون لولههاي حاوي ماده ضد انعقاد ریخته شد. نمونهها بهسرعت به آزمایشگاه ویروسشناسی دانشکده دامپزشکی شیراز منتقل گردید. نمونهها جهت انجام آزمایشهاي PCR سانتریفیوژ شد. بافیکوت جداسازي شده به میکروتیوب منتقل شد و روي میکروتیوب شماره نمونه ثبت شد. سپس میکروتیوبها تا زمان انجام مراحل بعدي در فریزر -70 درجه سانتیگراد نگهداري شد.
در مرحله بعد از گوساله و گاوهاي تشخیص داده در مرحله اول یا گوسالههاي متعلق به دامداريهاي با سابقه آلودگی خون گیري به عمل آمد. حدود 5 میلیلیتر از نمونه خون گرفتهشده به درون لولههاي حاوي ماده ضد انعقاد - EDTA - ریخته شد و بهآرامی مخلوط گردید. سپس در دور 1800 rpm به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ گردید که خون در سه فاز دیده شد. لایه بالایی که پلاسما است، با سمپلر کشیده و دور ریخته شد، لایه میانی حاوي بافیکوت است که بهصورت لایه سفیدرنگی دیده میشود.
بافیکوت، توسط سمپلر و با احتیاط جمعآوري گردید؛ بهطوريکه گلبولهاي قرمز موجود در لایه زیرین با بافیکوت چندان مخلوط نشد. در این مرحله علاوه بر تهیهي بافی کوت نمونهها بهصورت جداگانه، بافیکوت نمونههاي مخلوط - pool - شامل حداقل 20 نمونه بافی کوت جمعآوري گردید. در صورت مثبت بودن هر مجموعه 20 تایی بهصورت مجزا آزمایش RT-PCR جهت مشخص نمودن آلودگی و حضور آنتیژن بر روي تک تک نمونههاي مجموعه انجام شد. جهت تشخیص عفونت حاد از عفونت پایدار نمونهگیري - خون - از گاوهاي آلوده به عفونت حداقل 2 هفته بعد تکرار شد و بافیکوت نمونهها جداسازي شد. نمونهها تا انجام آزمایش RT-PCR در فریزر -70 درجه سانتیگراد نگهداري گردید.
استخراج RNA از بافیکوت
جهت استخراج RNA از نمونههاي بافیکوت از کیت استخراج Cinnapure RNA, RNA ساخت شرکت سیناژن استفاده گردید. RNAاستخراجشده تا زمان استفاده به فریزر -70 درجه سانتیگراد منتقل گردید.
پرایمرهاي مورداستفاده
جهت غربالگري اولیه و یافتن نمونههاي آلوده به پستی ویروسها، با استفاده از زوج آغازگرهاي 324 و 326 واکنش زنجیرهاي پلیمراز بر روي نمونههاي مخلوط انجام پذیرفت. پس از شناسایی نمونههاي مخلوط مثبت مجدداً آزمایش بر روي نمونهها بهصورت تکی انجام شد و نمونههاي مثبت شناسایی شد. سپس آزمایش nested PCR بر روي نمونههاي مثبت بهصورت تکی با استفاده از زوج آغازگرهاي OI 100 و 1400R و همچنین BD1 و BD2 انجام شد. جهت تشخیص نمونههاي PI، هر نمونه که در این مرحله مثبت میبود مجدداً آزمایش nested PCR بر روي بافیکوت جداشده از نمونههاي خون مرحله دوم انجام گرفت. جهت تشخیص سویههاي ویروس - سویههاي NADL و - UK، آزمایش PCR با استفاده از زوج آغازگرهاي BD1 و BD3 و همچنین BD1 و BD4 انجام پذیرفت.
