بخشی از مقاله
چکیده
تشخیص سریع بیماری و حذف سریع ماهیان آلوده در مراحل اولیه بیماری امری ضروری برای کنترل موثر شیوع بیماری در محیط های محصور دریائی و نیز مزارع آبزی پروری است. هدف اساسی در این تحقیق طراحی و تهیه یک روش سنجش به منظور تشخیص سریع و آسان نمونه های آلوده به ویروس - VNN - بود. در روش ایمنوکروماتوگرافی پادتن نشاندار شده با ذرات کلوئیدی طلا بر سایر نشانگرها ارجحیت دارد. ذرات طلا 30 نانومتری با غلظت های مناسبی از پادتن و در pH مشخصی پوشانیده شده و با آلبومین سرم گاوی پایدار گردیدند. سپس طراحی کیت ایمنوکروماتوگرافی برای تشخیص بتانوداویروس انجام شد. به این منظور حجم های مختلف کونژوگه طلا-پادتن بر روی پد کونزوگه ریخته و سپس مقادیر مختلف پلی کلونال آنتی بادی در خط تست قرار گرفت. همچنین به منظور تایید و اطمینان از عملکرد کونزوگه طلا-پادتن، خط کنترل حاوی پادتن ثانویه بر علیه پادتن موشی در منطقه مورد نظر قرار گرفت.
در نهایت اجزای کیت تکمیل و نمونه مغز کفال ماهیان مشکوک مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که این کیت قادر به شناسایی 103 بتانودایروس می باشد. در مرحله نهایی 50 نمونه سوپرناتانت مغز ماهی کفال طلائی که با استفاده از روش Real-time PCR و ایمونوهیستوشیمی، دارای تایید آلودگی با استفاده از کیت مزبور مورد ارزیابی قرار گرفتند. بطور کلی حساسیت و ویژگی این روش به ترتیب 64 و 100 درصد بود. صحت روش ایمونوکروماتوگرافی تقریبا با روش Real-time PCR و ایمونوهیستوشمی همخوانی دارد و در تست های غربالگری اپیدمیولوزیک می تواند بسیارمفید باشد.
کلمات کلیدی: کیت تشخیص سریع، نانوذره طلا، ایمونوهیستوشیمی، بیماری نکروز عصبی ویروسی
مقدمه
سازمان خواربار و کشاورزی - FAO - تخمین زده است که تقاضای سالیانه ی غذای دریایی تا سال 2025 به 55 میلیون تن افزایش خواهد یافت. بدون شک یکی از راههای موفقیت در صنعت آبزی پروری آینده، تشخیص سریع و زود هنگام و پیشگیری از بیماری آبزیان خواهد بود که هم اکنون بزرگترین عامل ضرر و زیان در صنعت پرورش آبزیان می باشند . - Zorriehzahra et al., 2016 - عدم تشخیص قطعی عامل بیماری زا درآبزیان، منجربه افزایش کاربرد آنتی بیوتیک ها شده و ضمن اینکه ممکن است به درمان قطعی منتهی نگردد، باعث توسعه مقاومت های داروئی نیز می شود، از اینرو طولانی شدن زمان شناسایی و تشخیص عامل بیماری زا موجب شیوع بیشتر بیماری، افزایش تلفات و خسارات بیشتر در کارگاه های پرورش ماهی و هزینه های ناشی از آن می گردد.
افزایشتعداد عوامل بیماریزای ویروسی و باکتریایی که باعث بیمارهای مهلک در سیستم های آبزی پروری شده اند منجربه توسعه ی روش های سریع برای تشخیص بیماری شده است . - Romalde et al., 1999 - تشخیص سریع بیماری و حذف سریع ماهیان آلوده امری ضروری برای کنترل موثر شیوع بیماری است. اقدام فوری در مراحل اولیه بیماری می تواند تاثیر بسزایی در میران شیوع بیماری داشته باشد . - Adams et al.,2008 - روش های تشخیص سریع در خارج از محیط آزمایشگاهی توسط افراد غیر ماهر از بروز این عفونت ها جلوگیری میکند. در سال های اخیر طراحی روش های سریع با دقت و حساسیت کافی به منظور جایگزین شدن با سایر روش های پیچیده و پرهزینه ایمنی سنجی مانند radioimmunoassay و ELISA مورد توجه محققین قرار گرفته است.
اغلب این روش ها براساس آگلوتیناسیون - agglutination - ، ایمونوکروماتوگرافی - ICG - و برخی از روش های مولکولی می باشد ICG . - Rjabibazl et al, 2010 - به عنوان یک ابزار تشخیصی در امورپزشکی و دامپزشکی کاربرد بسیار دارد. از مزایای این روش می توان به ساده و ارزان بودن، زمان سنجش کوتاه - ارائه نتایج ظرف مدت چند دقیقه - ، قابلیت حمل و همچنین عدم نیاز به تجهیزات پیچیده و کاردان های ماهر و ارزیابی نتایج از طریق چشم غیر مسلح اشاره کرد. این مشخصات، این روش را برای تشخیص در جا - on-site - به وسیله افراد مبتدی ایده ال نموده است . - Adams et al.,2008 - علاوه بر این، قابلیت اجرایی این روش در شرایط مزرعه از اهمیت زیادی برخوردار است چرا که تعداد کمی از مزارع پرورش ماهی دارای آزمایشگاه های تشخیص در خود محل می باشند . - Romalde et al., 1999 -
نکروز عصبی ویروسی - VNN - یا بیماری مغزی و شبکیه ای ویروسی - VER - یکی از مهمترین بیماری های ویروسی در ماهیان دریایی و آبزی پروری دنیا محسوب می شود. ویروس عامل بیماری نکروز عصبی متعلق به جنس بتانوداویروس - Betanodavirus - و خانواده نوداویریده - Nodaviridae - هستند . - Thiéry et al ., 2011 - تا به امروز، این بیماری در بیش از 50 گونه ماهی گزارش شده است، که عمده این گزارش ها مربوط به ماهیان دریایی می باشد. این بیماری در بسیاری از گونه های ماهیان آب شیرین نیز شناسایی شده است. از سال 2002 تا کنون، گونه های ماهیان آب شیرین حساس به بیماری VNN رو به افزایش است . - Athanassopoulou et al., 2004; Bigarré et al., 2009; - ویروس این بیماری ممکن است منجربه مرگ و میر صد درصدی در لاروها و بچه ماهیان گردد و باعث خسارات قابل توجهی در ماهیان بالغ شود.
این ویروس می تواند برای مدتی طولانی در میزبان بصورت تحت بالینی باقی بماند و تحت شرایط محیطی نامساعد باعث مرگ و میر شدید شود. بنابراین ردیابی ویروس قبل از ظهور علائم بالینی بسیار ضروری می باشد به طوریکه اقدامات مدیریتی بهداشتی و درمانی لازم برای جلوگیری از شیوع بیماری می تواند انجام پذیرد. اهمیت این مطالعات زمانی که برنامه توسعه روش های پرورش متراکم و پرورش ماهی در قفس - Cage culture - این ماهیان مد نظر باشد، دو چندان خواهد شد. زیرا در این حالت، به دلیل تراکم و افزایش میزان استرس های گوناگون استعداد ابتلا ماهیان به این بیماری و مواجهه با این ویروس افزایش می یابد. و از طرف دیگر حذف یا تفکیک مولدین حامل ویروس، با استفاده از کیت های سریع درست قبل از تخمریزی، برای جلوگیری از این بیماری بسیار موثر است.
مواد و روش ها
تعداد 40 قطعه کفال طلایی با علائم مزمن بیماری در محدوده وزنی 50 تا 250 گرم از سواحل جویبار، فریدونکنار و سرخرود استان مازندران در طول فصل صید در سال 1395، جمعآوری شدند و بلافاصله در مجاورت یخ به آزمایشگاه فیزیولوژی دانشکده علوم دامی وشیلات دانشگاه منابع طبیعی و کشاورزی ساری منتقل شدند. بعد از جداسازی سریع بافت چشم و مغز در شرایط کاملا استریل و در زیر هود، در فریزر با دمای منفی 70 درجه سانتیگراد تا زمان انجام آزمایش ذخیره شدند. در ادامه با استخراج RNA ویروسی ونیز طراحی آغازگر ها بر اساس پرایمرهای معرفی شده از سوی سازمان OIE شرایط و امکانات لازم جهت انجام آزمایش Real-time PCR به منظور انجام روش های تائید تشخیص بیماری صورت گرفت. در ادامه کار بر اساس استانداردهای مربوط به ساخت کیت های ایمونوکروماتوگرافی تلاش گردید که کلیه اجزای مورد نیاز این نوع کیت ها از جمله پد نیترو سلولز، تعیین اندازه نانو ذرات طلا، پوشانیدن - Conjugate - ذرات طلا با پادتن، آماده سازی کونژوگه پادتن- نانو ذره طلا همگی بر اساس دانش فنی و امکانات داخل کشور طراحی و اجرا گردد و تنها آنتی بادی مونوکلنال VNN را از کشور انگلستان وارد نمودیم. در نهایت تعیین حساسیت و ویژگی و صحت نوار سنجش سریع این کیت نیز مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج و بحث
توسعه یک روش حساس، با اختصاصیت بالا و کم هزینه برای شناسایی عوامل بیماری زا در آبزیان یک امر مهم در اجرای موفق برنامه غربالگری و تشخیص بیماری آبزیان محسوب می شود. با توجه به هزینه بالای برنامه غربالگری، برای کاهش هزینه ها می توان با طراحی سنجشی که قادر باشد در محل نمونه گیری بدون نیاز به انتقال نمونه به مراکز رفرانس، موارد مشکوک به بیماری را شناسایی نمود. در تحقیق حاضر برای شناسایی کفال ماهیان مشکوک نکروز عصبی ویروسی، اقدام به طراحی سنجش کیت ایمنوکروماتوگرافی، به روش ساندویچ با حد تشخیص - Detection limit - برابر 103 گردید. سادگی و اختصاصیت نوار تست برای تایید و کنترل عفونت VNN در مزارع قبل از شیوع بیماری بسیار مناسب خواهد بود.
این تست مزیتی نسبت به سایر روش ها دارد و این است که می تواند ظرف مدت 15 دقیقه بدون نیاز به ابزار خاصی اجرا شود. تشخیص زودهنگام ویروس و روش های قرنطینه مناسب، کنترل گسترش بیماری را آسان تر می سازد. بعلاوه، ارائه نتایج در سایر آزمایش ها تا حد زیادی به طول می انجامد، در نتیجه ویروس در طی این زمان فرصت تکثیر پیدا می کند. از آنجایی که کیت ها توسط افراد غیرمتخصص نیز قابل استفاده هستند و در مقایسه با سایر آزمایش های موجود ارزان قیمت هستند، این کیت ها برای غربالگری گسترده ذخایر ماهیان و ماهیان وارداتی مناسب و مقرون به صرفه خواهند بود. روش ایمنوکروماتوگرافی اگرچه دارای حساسیت کمتری می باشد اما می تواند به عنوان اولین روش در غربالگری بیماری ها استفاده شود و در مرحله بعد برای تایید نتایج از روش های دقیق تر استفاده نمود. درواقع سادگی و اختصاصیت نوار تست برای تایید و کنترل عفونت VNN در مزارع قبل از شیوع بیماری بسیار مناسب خواهد بود.
منابع
