مقاله تشخیص مقادیر اندک ملامین در نمونه های شیرخشک تقلبی به کمک ستون های کروماتوگرافی پرشده هدفمند

بخشی از مقاله

چکیده:

در این تحقیق یک روش سریع و حساس برای تعیین میزان ملامین در شیرخشک تقلبی با استفاده از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا ارائه شده است. جداسازی وتعیین مقدار ملامین در شیر خشک را توسط دو ستون متفاوت،-1ستون تجاری-2 - 25mm×4/6mm×5µm - SUPELCOSILTM LC-NH

ستون پر شده با مخلوط 50/50 نانوذرات سیلیکای اصلاح شده و میکرو ذرات پلیمر قالب مولکولی انجام شد و نتایج بدست آمده از دو ستون مقایسه و مورد تجریه و تحلیل قرار گرفت. منحنی کالیبراسیون خطی در شرایط کروماتوگرافی بهینه شده و بر اساس آن ارقام شایستگی روش در محدوده خطی کاری - 7/0 g/ml، 5/0، - 2/0 محاسبه شدند. تکرارپذیری - - %RSD<2/0، صحت - >99/16بازیابی - کارایی ستون - - N >10820، فاکتور ظرفیت - - 17/48، حدتشخیص 0/0037 g/ml و حداندازه گیری 0/0124 g/ml نتاج محاسبه شده از روش پیشنهادی می باشند.

-1مقدمه

ملامین - C3H6N6 - یک ترکیب صنعتی با درصد نیتروژن بالا می باشد که به صورت کریستالهای سفید یافت می شود و متاسفانه در برخی از فراورده های لبنی بکار رفته و در آزمون درصد پروتئین به طور کاذب درصد پروتئین را بیش از مقدار واقعی نشان می دهد. طبق استانداردهای سازمان جهانی بهداشت حداکثر میزان قابل تحمل دریافت روزانه ملامین برای اطفال معادل1میلی گرم و برای بزرگسالان معادل 2/5 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن است.

شیرخشک یکی از غذاهای استراتژیک در حوزه غذای کودک به شمار می رود که متاسفانه از سال 2008 گزارش های برای مصرف ملامین در شیرخشک و فراورد های مربوطه وجود دارد. باتوجه به آثار مخرب ناشی از مصرف این ترکیب در بدن و مخاطراتی که برای کلیه و سایر ارگان های بدن به همراه دارد، کنترل این قبیل فراورد ها به کمک روشی خودکار، سریع و انتخابی ضروری به نظر می رسد. تاکنون روش های مختلفی جهت تشخیص و اندازه گیری ملامین و آنالوگ های آن در مواد غذایی گزارش شده است که از آن جمله می توان به چند مورد اشاره کرد:

کرماتوگرافی مایع با کارایی بالا[2] ،طیف سنج جرمی زمان پرواز[3]،اسپکتروسکوپی رامان افزایشی سطح [4]،طیف سنجی فلورسانس [5]، کروماتوگرافی گازی و طیف سنج جرمی[6] ،کروماتوگرافی مایع و طیف سنج جرمی.[7]کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا - HPLC - همراه با شیوه های آشکارسازی مختلف یکی از پرکاربردترین روش های تجزیه ای برای تعیین مقدار ملامین می باشد. متداولترین شیوه HPLC مورد استفاده کروماتوگرافی با سیستم آشکارسازی جذبی - UV - می باشد.

در این مطالعه برای نخستین بار روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا همراه با دو دسته متفاوت از نانو ذرات برای جداسازی و تشخیص بهتر ملامین در نمونه های شیرخشک مورد استفاده قرار گرفت. دو ویژگی مهم افزایش نسبت سطح به حجم در کنار خصلت های افزایش مقاومت مکانیکی و بهبود خصلت انتخابگری برای تشخیص مقادیر اندک ملامین در شیرخشک مورد بهره برداری تجزیه ای قرار گرفت.

-1مواد و روش ها:

1-2 مواد

ملامین - %99< آلدریچ-سیگما - ، متاکریلیک اسید - - MAA - مرک - ، اتیلن گلیکول دی متا کریلات - - EGDMA - مرک - ،2و-2آزوبیس ایزوبوتیرونیتریل - AIBN - - سیگما - آلدریچ - ، استونیتریل و متانول - ویژه دستگاه HPLC و از شرکت مرک - ، تری آمینو پروپیل تری متوکسی سیلان - - APTMS - مرک - ، ، تترا اتیل اورتو سیلیکات - - TEOS - مرک - ، تری کلرو استیک اسید - مرک - ، -2 پروپانول - مرک - ، Tergitol - NP10 - - سیگما - آلدریچ - ،شیرخشک نان - نستله ایران - ، اسیدفرمیک - مرک - ، نانو ذرات سیلیکا تجاری - خریداری شده از شرکت نوترینونوآوران نانو-ساخت کشور اسپانیا - .

2-2 تجهیزات و شرایط کروماتوگرافی

سیستم کروماتوگرافی DIONEX متشکل از پمپ P680 ultimate ،سیستم تزریق اتوماتیک AI-100 با لوپ 20µl ،آشکار ساز170u UV،ستون تجاری SUPELCOSILTM LC-NH2 - 25cm×4.6mm×5µm - ، ستون پرشده با مخلوط نانوذرات سیلیکای اصلاح شده و میکرو ذرات پلیمر قالب مولکولی - 15cm×4.6mm - ، با شرایط طول موج 220 نانومتر ،سرعت جریان 0/7.ml/min، زمان بازداری10min ، فاز متحرک برای ستون تجاری محلول استونیتریل / آب 80/20 و برای ستون پرشده از شویش گردابی استفاده شد بدین ترتیب که آنالیز کروماتوگرافی با ترکیب 80 به 20 استونیتریل به آب آغاز شد و با یک شیب خطی به مدت زمان آنالیز، درصد استونیتریل به صفر و درصد آب به 45 افزایش داده شد. همچنین از طریق لوله انتقال فاز متحرک سوم، متانول با مخلوط کروماتوگرافی از صفر به 55 درصد افزایش داده شد.

3-2 تهیه MIP

سنتز پلیمر قالب مولکولی برای مولکول ملامین با روش سنتزی رسوبی با مکانیسم رادیکالی انجام شد.بدین منظور ملامین - 0/25 میلی مول، 31/5 میلی گرم - ، به لوله آزمایش 50میلی لیتری اضافه شد و با حلال استونیتریل به آب 5 - v/v 80/20 - دقیقه بوسیله همزن تکان داده و سپس به مدت 2 دقیقه در دستگاه سونیکیتور قرار دادیم، مونومر متااکریلیک اسید 3 - - MAA - میلی مول، 260میکرولیتر - ، کراس لینکر 14 - - EGDMA - میلی مول، 2/6 میلی لیتر - را به لوله آزمایش افزودیم .محلول کاملا شفاف حاصل به مدت 5 دقیقه توسط گاز نیتروژن گاز زدایی شد و آغازگر 0/82 - - AIBN - میلی مول، 134 میلی گرم - به آن اضافه شده و دهانه ظرف به دقت مسدود شد و به مدت 24 ساعت در دمای حمام 60oc قرار داده شد. پلیمر جامد سنتز شده از لوله آزمایش خارج شد و به مدت 24

شکل:1 روش تهیه AFSN

ساعت در معرض هوا قرار گرفت سپس شستشو در 5 مرحله و به مدت یک ساعت توسط 35 میلی لیتر محلول متانول - اسید استیک - v/v 10/1 - و دو مرتبه با آب مقطر انجام شد.نمونه های شسته شده را در آون که دمای آن 60oc بود قرار دادیم تا کاملا خشک شود. سپس نمونه های خشک شده را توسط هاون چینی به خوبی ساییدیم و برای آزمایشات بعدی در شیشه های در پوش دار نگاه داشتیم . لازم به ذکر است که سنتز NIP یا پلیمر غیر قالب مولکولی، تمام مراحل ذکر شده جهت سنتز MIP تکرار شد با این تفاوت که در سنتز NIP ملامین حضور نداشت

4-2 تهیه نانو ذرات سیلیکا به همراه گروه عاملی آمینی

در این مطالعه سنتز نانو ذرات سیلیکا با عامل آمینی طی یک واکنش کووالانسی انجام گرفت - شکل . - 1 جهت سنتز نانو ذرات مقدار8/8 میلی لیتر از -3 آمینو پروپیل تری متوکسی سیلان برداشته داخل یک ارلن 100میلی لیتری اضافه شد. سپس مقدار 44/66 میلی لیترازتترا اتیل اورتو سیلیکات به آن اضافه نمودیم. دو ماده را در حضور -2 پروپانول و سورفکتانت غیر یونی tergitol - NP10 - وآب به مدت 4 ساعت در دمای 25 0C توسط یک دستگاه شیکر، شیک نموده و سوسپانسیون حاصل را به مدت 15 دقیقه در با12000دور بر دقیقه سانتریفوژ کرده وسپس نانو ذرات ته نشین شده با آب مقطر یون زدایی شده شستشو شدند. بدین منظور 5 میلی لیتر آب مقطر به لوله سانتریفوژ افزوده شد و به مدت 15 دقیقه توسط همزن گردابی - ورتکس - بخوبی شستشو شدند. در ادامه مجددا عملیات سانتریفوژ انجام شد و نانو ذرات اصلاح شده جداسازی شدند

5-2 تعیین مشخصات ذرات پرکننده ستون HPLC

برای اطلاع از تشکیل حفرات در ذرات سنتزی، و آگاهی از مورفولوژی و اندازه آن ها از ذرات پلیمر قالب مولکولی و نانوذرات سیلیکا اصلاح شده عکس میکروسکوپ الکترونی روبشی - - SEM تهیه نمودیم. همچنین به منظور حصول اطمینان از اینکه سنتز نانو ذرات سیلیکا به طور موفقیت آمیز انجام گرفته و سطح آن با گروه آمین اصلاح شده است، از نانو ذرات سیلیکای آمینی سنتز شده و نانو سیلیکای تجاری خریداری شده طیفFT-IR در دامنه 400-0400 1 تهیه گردید.

6-2 تهیه ستون کروماتوگرافی هدفمند

برای پر کردن ستون HPLC از ستونی فولادی به طول 15 سانتی متر و قطر داخلی 4/6 میلی متر کاملا تمییز و خشک شده استفاده گردید.این ستون دارای دو مهره پیچی در دو انتهای ستون و دو نگهدارنده بود. مخلوط دوغابی 50به50 ذرات MIP ونانو ذرات سیلیکا اصلاح شده به کمک یک پمپ فشار بالا با فشار 12000 psiبطور کامل وارد ستون شد.ستون آماده شده با جریان ملایم - حدود 0/2 میلی لیتر بر دقیقه - با فاز متحرک آب / متانول 55/45 V/V شسته و دهانه ستون با سرپیچ اتصالی مناسب بسته شد. تنظیم و کنترل متغیرهایی همچون زمان، فشار پمپ، دانسیته مایعی که برای تهیه دوغاب انتخاب می شود، نسبت مایع و مواد پر کننده در دوغاب و حجم ظرف از اهمیت بالایی برخوردار است.

7-2 آماده سازی محلول های استاندارد

برای ساخت محلول مادر1000 g/ml ملامین،مقدار دقیق 0/1گرم ملامین وزن شده ودر 100 میلی لیتر محلول اسید فرمیک %2.5 حل گردید.محلول های استاندارد با غلظتهای 0/0 g/ml، 2/0، 4/0، 6/0، 8/0، 10/0 با رقیق سازی محلول مادر تهیه شدند. بدین صورت که جهت تهیه محلول استاندارد ملامین با غلظت10/0 g/ml ، یک میلی لیتر از محلول مادر برداشته و در بالن ژوژه های10 میلی متری با محلول استونیتریل-آب - - 80/20 V/Vبه حجم رسانده شد.

8-2 آماده سازی نمونه

31گرم ازشیر خشک را وزن کرده، مقدار5میلی لیتر تری کلرواستیک اسید%3 به آن اضافه شد، نمونه به مدت 15 دقیقه توسط دستگاه شیکر در دمای آزمایشگاه بهم زده شد. در مرحله بعد 5 میلی لیتر محلول استونیتریل به آن اضافه شد. سپس نمونه به مدت 30دقیقه در دمای4درجه سانتیگراد با12000دور بر دقیقه سانتریفوژگردید. در حین مراحل سانتریفوژ مقدار زیادی چربی در قسمت بالای نمونه تشکیل شد.مقدار2میلی لیتر از فاززیرین چربی برداشته شد و در یک بالن ژوژه 10میلی لیتری با محلول آب- استونیتریل - - 20/80V/Vبه حجم رسانیده شد.از محلول شیر خشک اولیه محلول های اسپایک شده از ملامین در سطح های 2/0 g/ml، 5/0، 7/0 تهیه شد. جهت تهیه اسپایک 2/0 g/ml، مقدار2 میلی متر از محلول شیر خشک اولیه برداشته شد و به آن - 0.02ml - 20µl از محلول مادر ملامین - 1000 g/ml - اضافه گردید و در یک بالن10 ml با محلول آب -استونیتریل - 20/80 v/v - به حجم رسانده شد.

-3 نتایج و بحث

1-3 تعیین مشخصه مواد پرکننده ستون

سطح خاص نانوسیلیکا و نانوسیلیکای عاملدار شده به ترتیب 347/6 m2/g و313/6 m2/g می باشند. عامل آمینی سطح خاص نانوسیلیکا را کاهش می دهد زیرا مولکول آمین با سطح نانو سیلیکا واکنش می دهد.در طیف FT-IR نانوسیلیکا یکسری خصوصیات پیوندی آن مشاهده می شود. - شکل. - 3نوار جذبی مشاهده شده در3430cm-1 از حرکات کششی پیوند هیدروژن گروه سیلانول - Si-OH - و - -OH - مولکول آب جذب شده نتیجه می شود. ظهور نوار جذبی در ناحیه cm-1 1630 مربوط به ارتعاشات خمشی OH مولکول آب جذب شده، میباشد.