بخشی از مقاله
چکیده
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum یکی از باکتریهای بیمارگر گیاهی مهم است که از acyl homoserine lactone به عنوان سیگنالهای سیستم حد نصاب احساس برای کنترل فاکتورهای بیماریزایی استفاده میکند. بهترین باکتریهایی که فعالیت خاموش کنندگی سیستم حد نصاب احساس را داشتند از تعداد زیادی از گیاهان جداسازی گردیدندو فعالیت QQ در آنها توسط باکتری بیوسنسور دستکاری ژنتیک شده Chromobacterium violaceum CV026 تعیین گردید. این باکتریها دارای قدرت بیوکنترلی مبتنی برQQ علیه Pcc بودند. دو مکانیسم عمده برای فعالیت QQ در این باکتریها مشاهده گردید:
-1 فعالیت آنزیمی داخل سلولی
-2 فعالیت آنزیمی خارج سلولی.
مهمترین باکتریهای دارای فعالیت Pseudomonas chlororaphis QQ، Pseudomonas putid بودند. چندین آغازگر برای ژنهای احتمالی دخیل در این فعالیت طراحی گردید. همولوگ های ژنهای آسیلازی pvdQ و quiP در تمام P. putid و P. chlororaphis یافت شدند اما برخی از و P. chlororaphis دارای سه آسیلازیpvdQ ، quiP و hacB بودند. همچنین این P. chlororaphis های داری سه ژن آسیلازی به عنوان بهترین عوامل بیوکنترل مبتنی بر QQ در بین تمام باکتریهای کوئنچر شناخته شدند.
-1 مقدمه
جنس Pectobacterium و خصوصا Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum - Pcc - یکی از مهمترین عوامل ایجاد کننده پوسیدگی نرم باکتریایی روی گیاهان مختلف است. پوسیدگی نرم باکتریایی روی بافتهای انباری سبزیها و گیاهان زینتی یکساله مانند سیب زمینی، هویج، پیاز، خیار، گوجه فرنگی و غیره ایجاد میشودPcc .[3 ] از عوامل مهم خسارتزای گیاهی در ایران محسوب میشود. این باکتری از مناطق و میزبانهای مختلفی در ایران گزارش شده است. اولین گزارش در آمل و روی ساقه گیاه دیفن باخیا بود.
اولین گزارش این باکتری روی سیب زمینی به عنوان مهمترین و اقتصادیترین میزبان این باکتری از استان فارس بود. کنترل این بیماری باکتریایی و به طور کلی برخی از بیماریهای باکتریایی گیاهی یک مشکل عمده در بخش کشاورزی است و غالباً کنترل آنها توسط سموم یا آنتی بیوتیک ها صورت می گیرد. بیش از پنجاه سال است که از مصرف سموم و آنتیبیوتیکها برای کنترل و درمان بیماریهای گیاهی و جانوری می گذرد، ولی استفاده نادرست و مداوم از این مواد باعث بروز پدیده مقاومت به سموم و آنتیبیوتیکها1 و پیدایش استرینهای مقاوم در باکتریها شده و درمان بیماریها در انسان، دام و گیاهان را با مشکل مواجه کرده است و - QS - Quorum Sensing .[16 یا سیستم احساس حد نصاب در باکتریها در واقع توانایی ایجاد فنوتیپهای جدید وابسته به دانسیته سلولی در این میکروارگانیسمها می باشد .
با تحقیقاتی که پیرامون ارتباطات بین سلولی در باکتری هاصورت گرفت مشخص گردید که باکتری هابه صورت گروهی فعالیت میکنند. در باکتری Pcc بیماریزایی بستگی به تولید گروههای مختلف آنزیمهای تجزیه کننده بافتهای گیاهی دارد از جمله پکتات لیازها، پلی گالاتورونازها، سلولازها و پروتئازهاPectobacterium .[20] با استفاده از سیستم QS به این اطمینان میرسد که تولید آنزیم های خارج سلولی تا زمانی که تعداد سلول های باکتری به حد نصاب لازم نرسیده، اتفاق نیفتد و AHL .[10 یکی از مهمترین گروه از این سیگنال ها می باشد که در بسیاری از باکتری های گرم منفی پاتوژن گیاهی نظیر Pcc وجود دارد
در واقع روند ممانعت از QS توسط تخریب سیگنال رسانی 2 - منظور هر یک از سیگنال هایی که در پدیده QS نقش دارند - است. استفاده از این مکانیسم در دو دهه اخیر مورد توجه زیادی قرار گرفته است . این پدیده به نام خاصیت کوئنچری یا - QQ - quorum quenching نیز شناخته می شود.
یافتن باکتری هایی که ترکیبات ضد باکتریایی آنها نه باکتری را از بین ببرند و نه رشد آن را متوقف کنند، نسبت به ترکیبات ضد باکتریایی معمول نظیر آنتی بیوتیک ها مزیت دارند چون منجر به ایجاد استرین های مقاوم باکتری نمی شوند از جمله این موارد می توان باکتری های دارای خاصیت کوئنچری را نام برد
تعداد زیادی از ، ژن های دخیل در پدیده QQ تا کنون در این باکتریها شناخته شده اند که همولوگ های این ، ژن ها را می توان در باکتری های مختلف یافت که دو گروه اصلی این ژنها شامل آسیلازها و لاکتونازها هستند.[25] از این رو یافتن باکتریهایی با آنزیم ها یا متابولیتهای دارای اثرات ضد QS می تواند یک روش نوین و موثر باشد تا از این طریق با بهکارگیری خود باکتری یا ، ژنهای آنزیمی یا متابولیت آن - بسته به اینکه کدام روش با توجه به مجموع شرایط موثرتر واقتصادیتر باشد - بتوان بیماری را کنترل کرد.
-2 مواد و روشها
-2-1 باکتری ها و ترکیبات مورد استفاده در این تحقیق شامل باکتری بیمارگر Pectobacterium carotovorum subsp. SCRI193 carotovorum - دارای3-oxo-C6-HSL به عنوان سیگنال اصلی دخیل در - QS، بیوسنسور Chromobacterium CV026 violaceumبرای ردیابی وجود سیگنال در محیط و سیگنال سنتزی oxo-C6-HSL - تهیه شده از شرکت - Sigma-Aldrichمی-باشند.
-2-2 نمونه برداری
به منظور جداسازی باکتری های کوئنچر3، از فیلوسفر، ریزوسفر و خاک اطراف گیاهان مختلف نمونهبرداری صورت گرفت. سپس نمونهها تا زمان استفاده در 4 درجه سانتیگراد نگهداری گردیدند.
-2-3 جداسازی
در این روش از منبع باکتریایی4 محیطهای ریزوسفر و فیلوسفر بدست آمده،طبق روش کریستین و همکاران، 2011 و موروهوشی و همکاران، 2009 استفاده شد6] و.[16 با ایجاد سری رقت از منبع باکتریایی، منبع رقیق شده روی محیط های TSA، R2A و LB مستقیما کشت گردیدند سپس تمام کلنی هایی که اندازه و رنگ یا شکل های متفاوت داشتند، در طی 14 روز از روی محیط های کشت برداشته شدند. مراحل ذکر شده برای دما های 25، 28، 30، 34 و 37 درجه سانتی گراد تکرار گردید.
-2-4 تشخیص خاصیت کوئنچری
برای بررسی فعالیت کوئنچری باکتری های جدا شده از CV026 استفاده گردید. باکتریهای مذکور در حضورمولکولهای سیگنال QS5 تولید رنگ ارغوانی ویولاسئین میکنند. ولی در صورت عدم وجود مولکولهای سیگنال، یا تجزیه سیگنالها و یا مولکولهای شبیه سیگنالها رنگ ارغوانی تولید نمیشود.این آزمون ها در دو مرحله روی همه باکتریهای کوئنچر جدا شده از تمام گیاهان صورت گرفت.
مرحله:1 در رقت 1/5 میکرومولار سیگنال 3-oxo-C6-HSL برای مدت زمان 24 ساعت انکوباسیون در مقابل باکتریهای کوئنچرهای فرضی و در چاهکهای پلیتهای 96 خانهای کشت سلولی انجام شد. هر چاهک حاوی باکتری که نسبت به شاهد رنگ کمرنگتری داشت، به عنوان باکتری کوئنچر مد نظر قرار گرفت.
