بخشی از مقاله
یک راه براي حل مسئله مقاومت آنتی بیوتیکی، کشف آنتی بیوتیک هاي جدید می باشد و به همین منظور یک باکتري گرم منفی، هوازي، کوکوباسیل، متحرك، اکسیداز و کاتالاز مثبت و قادر به تولید ماده ضد میکروبی قطبی از خاکهاي آلوده به مواد نفتی واقع در دزفول ایران ایزوله گشت و با استفاده از تست هاي فیلوژنتیکی 16S rDNA این باکتري با %99 به باکتري Alcaligenes faecalis شباهت داشت و همچنین با استفاده از تست هاي بیوشیمیایی باکتریایی، باکتري ایزوله شده تحت عنوان Alcaligenes faecalis زیر گونه faecalis شناسایی گشت. این باکتري در محیط هاي سیترات، استات، نوترینت براث، مولر هینتون براث و تریپتون سوي براث قادر به تولید ماده ضدمیکروبی می باشد.
فعالیت ضدمیکروبی باکتري به روش دیسک دیفیوژن بر روي میکروارگانیسم هاي اندیکاتور نظیر Bacillus subtilis، Escherichia coli، Candida albicans وAspergillus niger مشاهده گشت ولی هاله عدم رشدي علیه سویه تست شده انتروکوکوس فکالیس مشاهده نشد. فاز آبی بر روي میکروارگانیسم هاي اندیکاتور اثر ضد میکروبی داشت ولی فعالیت ضد میکروبی عصاره کلروفرمی واتیل استات بر روي هیچ کدام از میکروارگانیسم هاي فوق مشاهده نشد. با کشت سویه ایزوله شده تحت شرایط اپتیمم استات یا سیترات براث حاوي مواد پایه معدنی، pH 7-9 و دماي 35-40 °C تولید ماده ضد میکروبی افزایش یافته است.
کلمات کلیدي: آنتی بیوتیک، ضد میکروبی، Alcaligenes faeclis ، نفت و خاك
مقدمه
متابولیتهاي ثانویه مانند آنتی بیوتیکها براي سلولهاي تولید کننده آنها ضروري هستند چون که از میکروارگانیسمهاي دیگر که براي بدست آوردن منبع غذایی یکسان رقابت دارند، ممانعت می کنند - 3،. - 4 از آغاز شیمی درمانی تاکنون به دلایل متفاوت، نظیر مصرف بی رویه آنتی بیوتیکهاي رایج، شمار میکروارگانیسمهاي مقاوم به این آنتی بیوتیکها افزایش چشمگیري یافته است و یک راه براي حل این مشکل، جستجو و کشف آنتی بیوتیکهاي جدید میباشد. هدف از این مطالعه ایزوله کردن یک باکتري تولیدکننده ماده ضد میکروبی جدید بوده است که منجر به جداسازي باکتري Alcaligenes faeclis زیر گونه faeclis گشت. Alcaligenes faeclis باکتري گرم منفی، متحرك و هوازي است که به خانوادهAlcaligenaceae و کلاس beta proteobacteria تعلق دارد 1 - ،. - 3
مواد و روشها
-1 کشت و جداسازي باکتري
باکتري از خاكهاي آلوده به مواد نفتی واقع در شمال دزفول به روش کلاسیک ایزوله گشت و از محیط کشت نوترینت اگار جهت خالص سازي باکتري استفاده شد.
-2 شناسایی باکتري ایزوله شده
به منظور شناسایی دقیق باکتري ایزولهشده، از روشهاي مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و فیلوژنتیکی استفاده گشت.
-3 سویه هاي میکروبی اندیکاتور
جهت بررسی فعالیت ماده ضد میکروبی از میکروارگانیسمهاي Bacillus subtilis ATCC 465، Escherichia coliATCC 25922، Enterococcus faecalis PTCC 1238، Candida albicans ATCC 10231 و Aspergillus niger استفاده گشت.
-4 ارزیابی فعالیت ضد میکروبی
محیط کشت مایع باکتري با 3700×g به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ شد و سوپرناتانت را از فیلتر 0/2µmرد کرده و سپس بر روي دیسک هاي سلولزي بلانک با قطر 6/6 میلی متر تغلیظ کرده و به روش دیسک دیفیوژن طبق متد - 2 - بر روي میکروارگانیسم هاي اندیکاتور کشت شده روي محیط مولر هینتون آگار به مدت 24 ساعت در دماي 37 °C انکوبه گشت.
-5 اثر pH و حرارت بر روي فعالیت ماده ضد میکروبی
جهت بررسی اثر pH بین 2 تا 11، از محلول 0.1 N HCl براي درست کردن pH مختلف زیر pH= 7 و از محلول 0.1 N NaOH براي درست کردن pH مختلف بالاتر از pH=7 استفاده گشت و سپس نمونهها به مدت یک ساعت در دماي اتاق انکوبه شدند و سپس pH تمام نمونهها خنثی شدند - . - 5 جهت بررسی اثر حرارت بر فعالیت ماده ضد میکروبی ، نمونهها در دماهاي 42، 65، 80 و 100°C در طول زمان متفاوت 60 دقیقه و 121°C به مدت 15 دقیقه - اتوکلاو - تیمار شدند - . - 6
-6 انتخاب محیط کشت مناسب جهت بررسی رشد و تولید ماده ضد میکروبی
باکتري تولید کننده ماده ضد میکروبی در شرایط هوازي و شیکر انکوباتور با دماي 35 °C و دور100 rpm و pH=8 در ارلن هاي 250 میلی لیتر به مقدار 100 میلی لیتر از محیط کشت هاي کمپلکس نوترینت براث، مولر هینتون براث، تریپتیکاز سوي براث و محیطهاي سنتتیک پایه معدنی حاوي استات و سیترات به عنوان تنها منبع کربن و انرژي جهت بررسی رشد شیمو هتروتروفی و تولید ماده ضد میکروبی تلقیح گشت.
-7 تست قطبی و غیرقطبی بودن ماده ضد میکروبی
به نمونه سانتریفوژ شده، به میزان 1/5 حجمی، چندین بار کلروفرم اضافه شد و هر بار بعد از هم زدن فاز کلروفرمی جدا شد تا جایی که دیگر چیزي بیرون کشیده نشد و از لایه کلروفرمی،اتیلاستات و لایه آبی به روش دیسک دیفیوژن تست ضد میکروبی بر روي تمام میکروارگانیسمهاي اندیکاتور صورت پذیرفت.
نتایج
-1 کشت و جداسازي باکتري تولید کننده ماده ضد میکروبی
در این پژوهش یک باکتري کوکوباسیل، هوازي، متحرك، گرم منفی، اکسیداز و کاتالاز مثبت از خاك آلوده به مواد نفتی دزفول ایران ایزوله گشت.
-2 شناسایی باکتري ایزوله شده
با استفاده از روش فیلوژنتیکی 16 S rDNA، باکتري ایزوله شده با %99 به Alcaligenes faecalis، %98 به Rhodospirillum rubru شباهت داشت و با استفاده از تست هاي مرفولوژي و بیوشیمیایی، باکتري ایزوله شده، به عنوانAlcaligenes faecalis زیر گونه faecalis شناسایی شد.
-3 ارزیابی فعالیت ضدمیکروبی
در اطراف دیسکهاي حاوي ماده ضد میکروبی با استفاده از روش دیسک دیفیوژن هاله عدم رشد برBacellus subtilis ، Escherichia coli ، Candida albicans و Spergillus niger مشاهده گشت ولی هاله عدم رشدي برعلیه سویه Enterococcus faecalis مشاهده نشد.
-4 اثر pH و حرارت بر روي فعالیت ماده ضد میکروبی
تست پایداري نمونهها، کاهشی در فعالیت ماده ضد میکروبی در رنج pH بین 7 تا 11 ایجاد نکرد ولی در 5 pH و 6 فعالیت ماده ضد میکروبی به میزان قابل توجهی کاهش یافت و در pH زیر 5 هیچ هاله عدم رشدي مشاهده نشد. تیمار نمونه ها در دماهاي مختلف 42، 65، 80 و 100°C در زمان 60 دقیقه و همینطور نگهداري نمونه در دماي 4°C به مدت 24 ساعت، اثري بر روي فعالیت ضد میکروبی آنها نداشت ولی تیمار در دماي اتوکلاو حدود نیمی از فعالیت ماده ضد میکروبی را از بین برده بود.
-5انتخاب محیط کشت مناسب جهت بررسی رشد و تولید ماده ضد میکروبی
باکتري در محیطهاي کمپلکس نوترینت براث، مولر هینتون براث، تریپتیکاز سوي براث و محیط هاي سنتزي استات و سیترات به عنوان منبع کربن رشد کرده و تولید ماده ضد میکروبی می نماید - شکل 1و. - 2
