بخشی از مقاله
چکیده
از درختان مرکبات داراي علایم بیماري بلاست - citrus blast - در مناطق شرقی استان مازندران طی فصول پاییز و زمستان 1388 نمونه برداري شد. علایم به صورت لکه هاي نکروزه در دمبرگ ها که به سمت بالا و پایین محل اتصال دمبرگ روي ساقه پیشروي کرده و برگ هاي آلوده ي پیچ خورده و پژمرده ، بود. از تک پرگنه هاي مجزا هفتاد و نه جدایه باکتري فلورسنت از بافتهاي آلوده جدا و خصوصیات مرفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی آنها تعیین گردید. جدایه ها روي نهال هاي نارنج و لیمو بیماري زا بودند . نقوش الکتروفورزي پروتئینی جدایه ها مشابه جدایه استاندارد بود. .تنوع ژنتیکی جدایه ها در واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - با استفاده از آغارگر gyrB بررسی شدند. پس از توالی یابی و همردیف سازي با برنامه Clustal W توالی ژنgyrB جدایه هاي مرکبات 99 درصد به Pseudomonas viridiflava - pv - و72 درصد به جدایه Pseudomonassyringae pv. Syringae - pss - شباهت داشتند. با توجه به نتایج به دست آمده از تست هاي فنوتیپی و ژنوتیپی عامل بلاست جدایه هاي مرکبات به دست آمده به گونه Pv. تعلق دارند .
کلمات کلیدي : بلاست مرکبات، PCR, Pseudomonas viridiflava و آغازگر gyrB
مقدمه
جنس Pseudomonas یکی از متنوع ترین جنس هاي باکتریایی است و تاکسونومی آن از زمان توصیف دچار تغییرات زیادي شده است و از گدشته گونه هاي Pseudomonas فلورسنت اکسیداز منفی به دو گروه P. syringae وP. viridiflava تقسیم شده اند . - 7 - جدایه هاي Pv توسط دو تست تولید لوان و لهانیدن سیب زمینی از جدایه هاي Pss متمایز می شوند. به طوري که Pv لوان منفی است وقادر به لهانیدن برشهاي سیب زمینی می باشد در مقابل Pss تولید لوان کرده و قادر به لهانیدن ورقه هاي سیب زمینی تیست . در ایران عامل بلاست P. viridiflava معرفی شده است در حالی که در اغلب نقاط دنیا گونه Pss عامل بلاست است . - 10 - باکتري Pv از ایران از گیاهان مختلفی از قبیل : ریحان، اسفناج، همیشه بهار و مرکبات - 8و2 - ، توتون - 6 - گزارش شده است .
ژن gyrB به عنوان نشانگرهاي بسیار اختصاصی، زیرواحد پروتئینی DNA gyrase B را به رمز در می آورند - توپو ایزومراز نوع - 2 که به طور تصادفی در بین گونه هاي باکتریایی توزیع شده اند. - - 4 محصول ژن gyrB آنزیم DNA gyrrase است که در ایجاد سوپرکولینگ منفی در کرومزوم باکتري ها دخالت دارد و در تکثیر کروموزومی نقش مهمی دارد . - 11 - یاماموتو و همکاران بر اساس توالی ژن هاي rpo D وgyr B جدایه هاي P. putida را در دو گروه اصلی شامل استرین تیپ P. putida و همه بیووارهاي A این گونه و گروه دوم همه بیووارهاي B، P fluorescens و P. chlororaphis قرار دادند - . - 12
مواد و روش ها
از شاخه ها و برگهاي داراي علائم بلاست با غات مرکبات شهرهاي شرقی استان مازندران نمونه برداري و بر اساس تست هاي :L - LOPAT لوان، :O اکسیداز، :P لهانیدن سیب زمینی، :A هیدرولز آرژنین و :T واکنش فوق حساسیت - باکتري گرم منفی، هوازي و فلورسنت جدا شد. آزمونهاي بیوشیمیایی و فیزیولوژیک بر اساس روش هاي معمول باکتریولوژي - 9 - انجام شد. بیماري زایی جدایه ها روي نهال هاي نارنج - - Citrus aurantium L. و لیمو - C. limettioides Hort. Tan اثبات شد . الکتروفورز در ژل متراکم کننده پنج درصد و جدا کننده ده درصد پلی اکریل آمید در سیستم نا پیوسته لملی - 3 - و در شدت جریان ثابت 20 میلی آمپر تا رسیدن رنگ برم فنل بلو - bromphenolblue - به یک سانتی متري انتهاي ژل انجام گردید .
به منظور استخراج DNA جدایه ها در محیط NA - نوترینت آگار - کشت شدند پس از 24 ساعت رشد در دماي 25-28˚c ، در آب مقطر استریل به صورت سوسپانسیون درآمدند. کدري سوسپانسیون ها در 600 نانومتر به 0/1- 0/2 واحد تنظیم و به آنها 0/1 حجم هیدروکسید پتاسیم - KOH - یک نرمال اضافه شد. نمونه ها به مدت دو تا سه دقیقه در آب جوش قرار داده شدند. از محلول شفاف به دست آمده به عنوان DNA الگو - template - در واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - استفاده شد . - 1 - از دو جدایه استاندارد P.viridiflava ICMP - Intern. Collection of Microorganisms from plants, Auckland,276 New Zeeland - و P. s pv. syringae ICMP 3938 استخراج گردید.
انگشت نگاري DNA ژنومی با روش PCR و با استفاده از آغازگرهاي - DNA gyrase subunit B genes - gyrB طبق روشهاي توصیه شده و با کمی تغییر انجام شد - 12 و - 13 .محصولات PCR همراه با نشانگر وزن مولکولی در ژل 2درصد و با اختلاف پتانسیل 70 ولت الکتروفورز گردید. در آزمون PCR نمایندگان جدایه ها با آغازگر gyrB قطعه bp 1200 را تکثیر نمودند - شکل . - 1 توالی هاي نوکلئوتیدي به دست آمده، با استفاده از برنامه Blast با سایر توالی هاي موجود در بانک ژن - NCBI - مقایسه گردیدند و ارتباط فیلوژنتیکی جدایه هاي مرکبات و جدایه هاي بانک ژن با برنامه MEGA5 مقایسه شدند.
نتایج و بحث
در این بررسی از درختان مرکبات داراي علایم بلاست هفتادو نه جدابه به دست آمد . جدایه ها در ازمون هاي گرم، اکسیداز، هیدرولیز نشاسته، هیدرولیز آرژنین، احیاي نیترات و فعالیت تایروزیناز منفی و در کاتالاز، هیدرولیز ژلاتین، هیدرولیز اسکولین و فعالیت اوره آز مثبت بودند. همچنین در آزمون هاي تولید لوان و لهانیدن سیب زمینی متغیر بودند. . همه جدایه ها قادر به استفاده از دي-زایلوز، دي-گلوکز، ال-آسپاراژین، دي-تارتارات و لاکتات بودند ولی توانایی استفاده از سلوبیوز، دولسیتول، اتانول، ال-تارتارات و اگزالات را به عنوان منبع کربنی نداشتند. جدایه ها تولید واکنش فوق حساسیت در شمعدانی کردند و روي نهال هاي نارنج و لیمو بیماري زا بودند. جدایه ها در الگوي پروتئین هاي سلولی با جدایه استاندارد P.viridiflava - Pv. - شباهت داشتند. پس از توالی یابی و همردیف سازي با برنامه Clustal W ، توالی نوکلئوتیدي ژن gyrB جدایه هاي مرکبات 99 درصد به Pseudomonas viridiflava - pv - و72 درصد به جدایه Pseudomonas syringae pv. syringae - pss - شباهت نشان دادند و با توجه به نتایج به دست آمده از آزمون هاي فنوتیپی و ژنوتیپی جدایه هاي به دست آمده از مرکبات به گونه pv تعلق دارند.
