بخشی از مقاله
چکیده
باسیلوس ها، باسیل های گرم مثبتی هستند که نسبت به تغییرات محیطی مقاوم هستند . برخی از اعضای جنس باسیلوس آنتی بیوتیک تولید میکنند. در این مطالعه، جمع آوری 50 نمونه خاک طی دو بار نمونه گیری از مناطق دوهزار تنکابن انجام گرفت. پس از جمع آوری نمونه، به منظور جداسازی باکتری، از آزمون های بیوشیمیایی برای شناسایی دقیق سویه مورد نظر استفاده شد. پس از کشت باسیلوس های ریزوسفر و بررسی آنها مشخص شد که 11 ایزوله باسیل گرم مثبت اسپوردار مشکوک به باسیلوس بودند که با استفاده از تست های بیوشیمیایی انجام شده، 5 مورد از این باسیلوس های گرم مثبت به عنوان باسیلوس سرئوس مورد شناسایی قرار گرفتند.با توجه به آزمایش انجام شده و مطالعات سایرین مشخص می گردد که تعدادی از باسیلوس های خاک می توانند با قارچ های موجود بیماریزای انسانی و حیوانی اثرات آنتاگونیستی داشته باشند. البته پیگیری متابولیتهای تولیدی از این باسیلوس ها که اثر مهاری بر روی رشد قارچ ها را داشته باشند ضروری است.
.1 مقدمه
خاک یکی از مخازن عمده میکروب ها محسوب می شود. - Gohel et al., 2006 - خاک بطور طبیعی زیستگاه گروه وسیعی از باکتری ها است که منشأ محصولات بیواکتیو با فعالیت های فارماکولوژیک متنوع هستند، - Tanzi MG et - al., 2002با وجود آنکه بعضی از میکروارگانیسم ها در گیاهان ایجاد بیماری می کنند و اکثرا این بیماریها در مزرعه توسط آب پخش می شوند ولی حیات خاک وابستگی زیادی به فعالیت میکروارگانیسم های آن دارد.
- . - Weller,1988 فواید این میکروارگانیسم ها عبارتند از: ایجاد خاک در اثر تجزیه سنگها و صخره ها و باعث استحکام خاک توسط میکروارگانیسم های رشته ای مانند قارچ ها، استرپتومیست ها، اکتینومیست ها و جلبک ها.حفظ تعادل اکولوژی در خاک، این تعادل توسط باکتریوفاژها، ویروس ها، پروتوزئرهای شکاری و میکسوباکتری ها انجام می گیرد که با خوردن میکروارگانیسم های دیگر در فلورمیکروبی خاک تعادل به وجود می آورند.
تجزیه سموم کشاورزی و ازبین بردن حشرات موذی که بسیاری از باکتری ها بر ضد حشرات توکسین ایجاد می کنند از این میان باسیلوس پوپیلیه1 که سوسک ژاپنی را از بین می برد و باسیلوس تورنجینسیس2 که بر ضد پشه مالاریا استفاده می شود را می توان نام برد - Sanchis V& . - Bourguet D,2008 میکروارگانیسم ها نقش مهمی در چرخه کربن و ازت دارند و بیشتر ازت موجود در خاک توسط باکتری ها تامین می گردد و در اثر فتوسنتز Co2 به مواد آلی تبدیل می شود و میکروارگانیسم ها در اثر تجزیه این مواد Co2 را به جو بر می گردانند. - - puri,2015
جنس باسیلوس3 ، باسیل های گرم مثبت بزرگی هستند که بصورت هوازی یا بی هوازی اختیاری اند و در شرایط نامساعد تولید اندوسپور کرده و بدلیل تشکیل اسپور این باکتری ها سال های زیادی می توانند در محیط باقی بمانند. - . - Delvecchio V et al., 2006 and Amadio AF et al., 2009در جنس باسیلوس تعداد زیادی باسیل های درشت، گرم مثبت اسپوردار وجود دارد که در طبیعت فراوانند، زیرا اسپور آنها در برابر عوامل خارجی زیاد مقاومت دارد و بقای نسل آنها را تامین می کند. باسیلوس ها اهمیت زیادی از لحاظ پزشکی و اقتصادی دارند یکی از آنها بنام باسیلوس آنتراسیس4 برای انسان و بعضی حیوانات بیماری زا بوده و ایجاد بیماری سیاه زخم5 را می نماید. - Andrup Letal,2008 -
بعضی از آنها مانند باسیلوس سرئوس6 ایجاد مسمومیت غذایی می کنند. برخی نیز به علت قدرت تخمیری زیاد باعث تجزیه مواد قندی و پروتئینی شده و باعث فساد و گندیدگی مواد غذایی می گردند. از عده ای از آنها نیز آنتی بیوتیک تهیه می شود. - Granum PE,2007 - تعداد بسیاری از آنها به حالت ساپروفیت7 در هوا ، خاک، آب ، شیر ، سبزیجات، گردو غبار، مدفوع و غیره زندگی می کنند که از نظر شکل ظاهری و رنگ آمیزی به باسیلوس آنتراسیس شباهت دارند و به نام انتراکوئید8 نامیده می شوند. به علت هتروژن بودن انواع این جنس روش های مختلف طبقه بندی تاکنون ارائه گردیده که هیچکدام رضایت بخش نمی باشد. زیرا این باکتری ها از نظر مولکول گوانین باضافه سیتوزین درصد DNA ، متابولیسم، تغذیه، ترکیب دیواره سلولی ، درجه حرارت و pH مناسب برای رشد و غیره بسیار متنوع می باشد. - - Balouiri M etal,2015
اسپور گذاری این باسیل در انتهای فاز لگاریتمی و بکندی صورت می گیرد. برای ایجاد اسپور نیز وجود اکسیژن ضروری است. مقاومت باسیل سیاه زخم شبیه مقاومت سایر باکتری های بدون اسپور است و در مدت چند دقیقه در شصت درجه حرارت از بین می روند ولی اسپور آنها بخصوص اگر خشک شده باشد در برابر عوامل فیزیکی و شیمیایی زیاد مقاومت دارد. - - Kim k, et al,2005 از فرم هایی که ایجاد بیماری در انسان می کند می توان به سیاه زخم پوستی، تنفسی، گوارشی اشاره کرد.
باسیلوس سرئوس هوازی و اسپوردار می باشد. اسپور باکتری معمولاً در حبوبات، سبوس گندم، برنج و شیر، گوشت پخته ، مرغ و سایر مواد غذایی وجود دارد. بعضی از اسپور ها حتی پس از پختن هم در غذا باقی می مانند و در صورتی که مواد غذایی در شرایط گرم و مرطوب نگهداری شوند اسپور ها به باسیل تبدیل شده و پس از تکثیر در غذا یا روده انتروتوکسین ترشح می نماید که منجر به مسمومیت غذایی می شود. - Barbe V,2009 -
بطور کلی میکروارگانیسم هائی که برای جمعیت رقیب مواد سمی تولید می کنند بطور طبیعی برتری رقابتی دارند. این حالت از ارتباط بین دو جمعیت تضاد - آنتاگونیسم - 1 نامیده می شود.باکتریوسین ها به طور وسیعی در کلیفرم ها ی گرم منفی ولاکتوباکتر های گرم مثبت گزارش شده اند. به دلیل محدودیت طیف اثر باکتریوسین ها نسبت به آنتی بیوتیک ها کمتر مورد توجه میکروبیولوژیست ها قرار گرفته اند. - - Symond, 1983هدف ما در این پژوهش تعیین و شناسایی باسیلوس های ریزوسفر خاک منطقه ی دوهزار تنکابن و بررسی اثرات ضد قارچی آن ها می باشد. همچنین تعیین نوع و تشخیص باسیلوس های قابل کشت در خاک های ریزوسفریک و تعیین اثر ضد قارچی باسیلوس های شناسایی شده جدا شده علیه پاتوژن های قارچی گیاهی و حیوانی را بررسی خواهیم کرد.
مواد و روش کار:
محیط نوتریت آگار، محیط سابورود دکستروز آگار، محیط مولر هینتون آگار، نوترینت براث از محیط های کشت بوده و محیط های مورد نیاز برای انجام تست های بیوشیمیایی می توان به محیط تجزیه ی نشاسته، محیط احیای نیترات، محیط SIM ، MR-VP ، سیمون سیترات، محیط اوره آز، محیط نمکی با غلظت %7 اشاره کرد.نمونه گیری از خاک اردیبهشت ماه 1394 - از 50 جای متفاوت، در زمینی به مساحت 20 متر مربع - واقع در منطقه ی پرده سر دوهزار تنکابن انجام شد.
نمونه گیری از هر منطقه بطور جداگانه و مرحله ای انجام شد. از هر منطقه نمونه های متعدد ریزوسفری از خاک ریشه ای گیاهان و بوته های مختلف موجود در منطقه و از عمق 10-7,5 سانتی متری خاک تهیه شد و بدلیل هوازی بودن باسیلوس ها سعی شده نمونه گیری از سطوح بالایی خاک صورت گیرد. بنابراین با کنار زدن حدود 7 سانتی متر از خاک سطحی از عمق مورد نظر حدود 1 گرم خاک توسط یک قاشق چوبی استریل برداشته و در بسته های نایلونی جمع آوری شدند و درب آنها محکم بسته شد. کیسه های حاوی نمونه های هر منطقه 10 - منطقه - برای شروع تحقیقات به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه آزاد واحد تنکابن منتقل شدند.
در ابتدا 50 نمونه خاک داشتیم - هر کدام به مقدار 1گرم - هر کدام از آن ها را بطور جداگانه در 10لولهی آزمایش که هر کدام حاوی 9 میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل است منتقل شد و این لوله ها را بمدت 30 دقیقه در بن ماری 80 درجه سانتی گراد قرار دادیم. که تحت تاثیر شوک حرارتی قرار داده شود تا سلول های رویش و باقیمانده سلول های اسپوردار از بین برود.در مرحله ی بعد برای هر یک از لوله ها 10 - لوله - 3 لوله بعنوان رقت در نظر گرفتیم و حدود 9 سی سی سرم فیزلویوژی استریل در این لوله ها ریخته شد.
از لوله ی 1 به مقدار 1 سی سی به لولهی - 1-1 - منتقل شد و پس از تعویض سرسمپلر از لوله ی 1 - 1- 1 - سی سی وارد لوله ی - 1-2 - کردیم و بازهم با تعویض سرسمپلر از لوله ی - 1-2 - با هم 1 سی سی وارد لوله ی - 1-3 - کردیم تا لوله 10 ،همزمان با این کار محیط نوتریت آگار را ساختیم بعد در زیر هود در شرایط استریل کار خود را شروع کردیم از رقت سوم - 10-3 - هر کدام از لوله ها 10 - لوله - مقدار 2cc در 2 پلیت ریختیم - تکرار را انجام دادیم - ، پلیت ها را در جهت و خلاف جهت عقربه های ساعت - حرکت - 8 حرکت دادیم تا در هم حل شدند و بمدت 2 تا 4 روز پلیت ها در محیط آزمایشگاه قرار دادیم - 30oc - و بعد از چند روز از لحاظ رشد و تولید هاله شفاف بررسی شدند.
جداسازی باسیلوس ها
همانطور که گفتیم از هر رقت10- 3 هر لوله در دوپلیت ریختیم، پس از گذشت 4 تا 5 روز شاهد رشد هر 20 پلیت بودیم. سپس بر روی همه ی پلیت هایی که دارای کلونی مشکوک به باسیلوس بودند، رنگ آمیزی گرم انجام دادیم، آن هایی که زیر میکروسکوپ دارای باسیل گرم مثبت اسپوردار بودند مورد نظر ما بودند. این پلیت ها شامل B1 ، B2 ، B3 ، B4 ، B5 ، B6 ، B7 ، B8 ، B9 ، B10 ، B11بودند که این کلنی ها مشکوک به باسیلوس بود که رنگ آمیزی گرم شدند سپس این کلنی ها جهت خالص سازی مجدد به محیط کشت نوترینت آگار منتقل شدند تا کشت خالص خطی از آن ها تهیه شود و این پلیت های کشت داده شده را بمدت 2 تا 4 روز در شرایط آزمایشگاهی قراردادیم.
